吳 玲， 田澤丹， 陳 楠， 胡 薇， 周成富， 杜 權(quán)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科， 重慶 400010)

在圍手術(shù)期，機體針對組織損傷和感染應(yīng)激發(fā)生炎癥反應(yīng)，適度的炎癥反應(yīng)有利于機體發(fā)揮防御能力，當(dāng)喪失局部控制或激發(fā)全身反應(yīng)時，即發(fā)生全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是一種存在于細胞質(zhì)中的多蛋白復(fù)合物，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵復(fù)合體，主要由NLRP3、含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)和caspase-1前體組成。當(dāng)宿主受到微生物刺激或者內(nèi)源性損傷刺激信號時，NLRP3被激活，通過ASC招募caspase-1前體組裝成活化的炎癥小體，產(chǎn)生有活性的caspase-1，剪切白細胞介素(interleukin, IL)-1β和IL-18的前體使其成熟，發(fā)揮促炎作用[1-2]，其中NLRP3的表達水平是決定NLRP3炎癥小體活性的主要因素。皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)是應(yīng)激時下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸的最終直接產(chǎn)物，通過調(diào)控炎癥作用而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[3]，但皮質(zhì)酮對炎癥的調(diào)控是否與介導(dǎo)NLRP3的表達降低有關(guān)，尚不明確。近年來國內(nèi)外相關(guān)研究報道稱多種結(jié)構(gòu)各異的分子可激活NLRP3炎癥小體，它們均能促進信號分子活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，后者可能是它們活化NLRP3炎癥小體的共同主要機制[4-6]，而且目前較為認可的是線粒體來源的ROS[7-8]。已有研究指出，黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)主要介導(dǎo)線粒體ROS的產(chǎn)生[9]，所以假設(shè)CORT是通過XO調(diào)控巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的活化。本研究擬構(gòu)建NLRP3炎癥小體的活化模型，探討XO對CORT調(diào)控細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞RAW 264.7內(nèi)NLRP3炎癥小體的影響，進一步為探討CORT發(fā)揮抗炎作用的機制進行深入研究，以提供調(diào)控炎癥的新靶點。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

小鼠巨噬細胞株RAW 264.7由重慶醫(yī)科大學(xué)感染實驗室惠贈。LPS、別嘌呤醇(allopurinol，XO拮抗劑)和CORT均購自Sigma；抗黃嘌呤氧化酶抗體購自Abcam；抗NLRP3抗體購自CST；抗GAPDH抗體購自Bioworld；抗caspase-1抗體購自ImmunoWay；RNAiso Plus、Prime Script RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq 均購自TaKaRa；NLRP3、XO和GAPDH的mRNA引物由TaKaRa合成；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和抗生素購自HyClone；DMED培養(yǎng)基購自Gibco。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)、構(gòu)建炎癥模型 RAW 264.7細胞系培養(yǎng)于含10% FBS和1%抗生素(100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的DMED培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞處于對數(shù)生長期時，加入LPS致最終濃度為1 mg/L，使細胞形態(tài)變成多角形，伸出偽足數(shù)量明顯增多，構(gòu)建成熟的炎癥模型。

2.2CORT濃度梯度的設(shè)置 分別用濃度為100、300、500、700和900 μg/L的CORT預(yù)處理巨噬細胞1 h，再構(gòu)建炎癥模型(1 mg/L LPS)，1 h后提取細胞總蛋白為實驗對象。

2.3藥物預(yù)處理及時間梯度的分組設(shè)置 LPS組細胞在構(gòu)建炎癥模型后0、0.5、1、1.5和2 h提取細胞成分,0 h為對照(control)組；CORT+LPS組細胞加入CORT致最終濃度為700 μg/L預(yù)處理1 h，構(gòu)建炎癥模型后于0.5、1、1.5和2 h提取細胞成分；allopurinol+LPS組細胞加入allopurinol至最終濃度為250 mg/L預(yù)處理1 h，構(gòu)建炎癥模型后于0.5、1、1.5和2 h提取細胞成分。

2.4Western blot法檢測NLRP3、caspase-1和XO蛋白的表達 按細胞總蛋白提取試劑盒提取各組細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)過高溫變性使蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，各孔分別加入樣品蛋白30 μg，經(jīng)過電泳、濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在TBST緩沖液(含5%脫脂奶粉)中于室溫封閉1 h，分別按說明書加入相應(yīng)稀釋濃度的Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，再加入相應(yīng)稀釋濃度的Ⅱ抗于室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL法顯影蛋白印跡，實驗重復(fù)3次。

2.5Real-time PCR法檢測NLRP3和XO mRNA的表達 棄各組細胞的培養(yǎng)上清，無菌無酶的PBS緩沖液清洗貼壁細胞3次，加入1 mL RNAiso Plus，吹打40～60次，使細胞充分裂解，動作輕柔，按RNAiso說明書提取各組細胞總RNA，使A260/A280均在1.8～2.0之間。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄及擴增。PCR擴增條件為95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法行PCR產(chǎn)物相對定量分析，實驗重復(fù)3次。引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，序列見表1。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物序列

結(jié) 果

1 LPS誘導(dǎo)NLRP3的表達

1.1LPS上調(diào)NLRP3的蛋白表達 1 mg/L的LPS處理巨噬細胞，在0.5 h～2 h間NLRP3的表達水平均有不同程度增加，相比對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，于2 h表達量最高，見圖1。

Figure 1. The protein levels of NLRP3 in the RAW 264.7 cells treated with LPS at 1 mg/L. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1LPS(1mg/L)刺激巨噬細胞后不同時點NLRP3蛋白水平的變化

1.2LPS上調(diào)NLRP3的mRNA表達 在LPS刺激后1 h～2 h NLRP3的mRNA表達水平高于對照組(P<0.05或P<0.01)，0.5 h的mRNA表達水平稍增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2。

2 CORT對NLRP3和caspase-1的蛋白表達的影響

當(dāng)CORT低于300 μg/L時，NLRP3的蛋白水平與對照組相比顯著上調(diào)(P<0.05)；當(dāng)CORT高于700 μg/L時，NLRP3的蛋白表達明顯減少(P<0.05)，并同步減少cleaved caspase-1的蛋白水平(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. The mRNA expression of NLRP3 in the RAW 264.7 cells treated with LPS at 1 mg/L. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2LPS(1mg/L)刺激巨噬細胞后不同時點NLRP3mRNA的相對表達情況

3 CORT下調(diào)NLRP3表達的同時抑制XO的表達

3.1CORT使NLRP3和XO的蛋白表達減少 與LPS組相比，CORT逐漸降低NLRP3的蛋白表達水平(P<0.05或P<0.01)，至2 h表達量最低；在CORT作用后1.5 h和2 h XO的蛋白表達亦減少(P<0.05)，于2 h最低，見圖4。

3.2CORT下調(diào)NLRP3和XO的mRNA表達 在CORT+LPS作用后0.5 h至2 h,NLRP3的mRNA表達與LPS組相比顯著下調(diào)(P<0.01)；XO在1.5 h和2 h的mRNA表達亦顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖5。

4 Allopurinol減少NLRP3的表達

4.1Allopurinol減少NLRP3的蛋白表達 在allopurinol+LPS處理后，NLRP3在1 h至2 h的蛋白表達量相比LPS組顯著降低(P<0.01)，見圖6。

4.2Allopurinol下調(diào)NLRP3的mRNA表達 在allopurinol+LPS處理后1 h至2 h，NLRP3的mRNA表達水平低于LPS組(P<0.01)，見圖7。

討 論

在發(fā)生急性炎癥的早期，機體啟動促炎和抗炎2種機制，決定著炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，巨噬細胞等炎癥細胞滲出是炎癥反應(yīng)最主要的特征，它作為重要的天然免疫細胞，在炎癥調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。本研究以小鼠巨噬細胞RAW 264.7作為實驗對象，用脂多糖構(gòu)建炎癥模型，結(jié)果表明在炎癥發(fā)生的2 h內(nèi)，NLRP3表達增強，于2 h反應(yīng)最活躍。NLR作為重要的胞內(nèi)模式識別受體，激活后形成炎癥小體復(fù)合物，而NLRP3的表達水平是決定NLRP3炎癥小體活性的主要因素。本實驗證明LPS可激活巨噬細胞內(nèi)的NLRP3炎癥小體通路，促進炎癥的發(fā)生，與已有研究結(jié)果一致[10-11]，構(gòu)建了由LPS激活NLRP3炎癥小體的模型。機體在圍術(shù)期受到應(yīng)激時，HPA軸被激活，釋放糖皮質(zhì)激素，可顯著抑制LPS介導(dǎo)的鼠巨噬細胞炎癥反應(yīng)，而CORT作為嚙齒類動物最主要的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素，發(fā)揮抗炎作用與介導(dǎo)炎癥小體的表達降低有關(guān)。本研究選用0～900 μg/L皮質(zhì)酮主要是為了觀察不同應(yīng)激條件下皮質(zhì)酮的免疫調(diào)控作用。Dhabhar等[12]研究指出，50 μg/L CORT等同于機體在應(yīng)激時產(chǎn)生的生理皮質(zhì)酮水平，對巨噬細胞產(chǎn)生免疫刺激作用，在一定程度上對機體在早期適應(yīng)急性應(yīng)激作出了解釋。本研究結(jié)果說明，低于300 μg/L的CORT促進炎癥小體的釋放以刺激機體的免疫功能，但700 μg/L時反而抑制作用最明顯，發(fā)揮強效的抗炎作用。

Figure 3. The protein levels of NLRP3 and caspase-1 in the RAW 264.7 cells treated with CORT at different concentrations. Mean±SD.n=6.*P<0.05,P<0.01vs0 μg/L.

圖3不同濃度的CORT與LPS(1mg/L)刺激細胞后NLRP3和cleavedcaspase-1蛋白水平的變化

Figure 4. The protein levels of NLRP3 and XO in the RAW 264.7 cells treated with CORT and LPS. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

圖4CORT(700μg/L)與LPS(1mg/L)作用于巨噬細胞后各時點NLRP3和XO蛋白水平的變化

Figure 5. The mRNA expression of NLRP3 and XO in the RAW 264.7 cells treated with CORT and LPS. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

圖5CORT(700μg/L)與LPS(1mg/L)作用于巨噬細胞后各時點NLRP3和XO的mRNA相對表達情況

Figure 6. The protein levels of NLRP3 in the RAW 264.7 cells treated with allopurinol and LPS. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

圖6Allopurinol(250mg/L)預(yù)處理及LPS刺激巨噬細胞后不同時點NLRP3蛋白水平的變化

Figure 7. The mRNA expression of NLRP3 in the RAW 264.7 cells treated with allopurinol and LPS. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsLPS group.

圖7Allopurinol(250mg/L)預(yù)處理及LPS刺激巨噬細胞后不同時點NLRP3的mRNA相對表達情況

CORT通過抑制NLRP3炎癥小體的活性發(fā)揮抗炎作用，但調(diào)控炎癥小體的機制復(fù)雜不清，目前國內(nèi)外相關(guān)研究較少?，F(xiàn)研究已證實多種途徑可激活NLRP3炎癥小體，如細胞內(nèi)的ROS、組織蛋白酶B(cathepsin B)和胞內(nèi)蛋白激酶R等，其中細胞內(nèi)ROS在LPS活化的NLRP3炎癥小體中發(fā)揮著重要的作用[13-15]，ROS可直接促硫氧還原蛋白互動蛋白與NLRP3結(jié)合，進而激活NLRP3并組裝成活化的炎癥小體，促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生[16]，尤其與線粒體ROS關(guān)系密切。Ives等[9]研究表明，XO介導(dǎo)線粒體ROS的產(chǎn)生，并調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活及促炎因子的剪切。因此，本實驗假設(shè)在調(diào)控炎癥反應(yīng)的小鼠巨噬細胞中，CORT下調(diào)NLRP3炎癥小體的活性與抑制XO的表達水平有關(guān)。本實驗結(jié)果表明，較高濃度CORT(高于700 μg/L)在炎癥發(fā)生的2 h內(nèi)下調(diào)NLRP3的表達，減輕LPS誘導(dǎo)的鼠巨噬細胞炎癥反應(yīng)，同時抑制XO的表達水平，可見較高濃度CORT(高于700 μg/L)對LPS誘導(dǎo)的鼠巨噬細胞內(nèi)NLRP3表達的抑制作用。XO的拮抗劑allopurinol使NLRP3的表達水平降低，說明NLRP3的表達與XO有關(guān)。

本研究初步確認，較高濃度CORT能抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞內(nèi)NLRP3的表達，后者與XO有關(guān)，而CORT的抑制作用可能與其下調(diào)XO的表達水平有關(guān)。此結(jié)果進一步說明XO作為線粒體ROS的工具酶，介導(dǎo)了LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的表達，而皮質(zhì)酮通過調(diào)控XO抑制NLRP3炎癥小體的活化，后續(xù)有待于進一步在人巨噬細胞中加以驗證。本研究闡釋了內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素發(fā)揮抗炎效應(yīng)的機制，為炎癥的干預(yù)措施提供了新工具。

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