姚 森，李 濤，劉鴻高，李杰慶,*，王元忠*

野生食用菌富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維和多種礦質(zhì)元素，經(jīng)常食用可以增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)人體新陳代謝，能夠有效預(yù)防和治療腫瘤、痢疾、水腫等疾病，兼具食藥用價(jià)值[1-3]。其味道鮮美，口感細(xì)膩，已遠(yuǎn)銷歐美等國(guó)家，極具開發(fā)價(jià)值[4-5]。云南被稱為“食用菌王國(guó)”，種類繁多，分布廣泛，因生長(zhǎng)環(huán)境不同，其代謝產(chǎn)物種類及含量發(fā)生變化，導(dǎo)致同種類不同產(chǎn)地食用菌品質(zhì)存在差異[6]。對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)地鑒別，為食用菌資源開發(fā)與利用提供參考依據(jù)，同時(shí)為野生食用菌的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。

目前，對(duì)食用菌鑒別分析方法除了簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)方法外，光譜法和分子生物法應(yīng)用較廣泛[7-8]。Li Yan等[9]采用紫外光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)3 個(gè)不同產(chǎn)地野生茯苓進(jìn)行快速鑒別，結(jié)果表明其紫外光譜具有指紋特性，結(jié)合聚類分析可準(zhǔn)確區(qū)分不同產(chǎn)地茯苓；Lian Bin等[10]采用分子生物法，根據(jù)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）設(shè)計(jì)引物，成功鑒別區(qū)分了美味牛肝菌（Boletus edulis Bull.）和其他蘑菇。單一的光譜技術(shù)對(duì)樣品信息提取率低，容易受到其他因素（CO2、H2O等）干擾；分子生物法需要昂貴的儀器設(shè)備，不適宜推廣應(yīng)用。

數(shù)據(jù)融合技術(shù)將多種儀器獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化、整合，豐富樣品信息，實(shí)現(xiàn)儀器間的互補(bǔ)，獲得更全面、可靠的數(shù)據(jù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)構(gòu)建判別模型，對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)的分析[11-13]。數(shù)據(jù)融合分為初級(jí)融合、中級(jí)融合和高級(jí)融合，初級(jí)數(shù)據(jù)融合是將不同儀器獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單的串聯(lián)，形成更全面的數(shù)據(jù)集[14]；中級(jí)融合也稱為特征級(jí)融合是將不同來源的數(shù)據(jù)經(jīng)過特征提取，并對(duì)選取的特征變量（如主成分、變量在投影方向的重要程度等）進(jìn)行整合，去除干擾信息，從而獲得更加豐富、系統(tǒng)的數(shù)據(jù)集[15-16]；高級(jí)融合亦被稱作決策級(jí)融合，通過兩個(gè)或兩個(gè)以上分類模型得出最優(yōu)鑒別結(jié)果[17-18]。在已有的研究中，僅有10%的融合技術(shù)采用了高級(jí)數(shù)據(jù)融合[19]。在本研究中，采用初級(jí)融合和中級(jí)融合技術(shù)已經(jīng)達(dá)到了預(yù)期效果，無須對(duì)高級(jí)融合技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)采用紫外光譜法和紅外光譜法，紫外指紋圖譜技術(shù)根據(jù)峰形、吸收波長(zhǎng)、吸光度等差異，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可用于分析物質(zhì)間差異具有操作簡(jiǎn)便、快速、整體性強(qiáng)、成本低等特點(diǎn)[20-21]；紅外光譜能有效反映出樣品的組分特征，是一種綜合性檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量控制、物種鑒別等方面，具有快速、簡(jiǎn)便、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)[22-23]。通過二階導(dǎo)數(shù)（second derivative，2D）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（standard normal variate，SNV）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、Savitzky-Golay平滑（15點(diǎn)平滑）等方法對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理，采用偏最小二乘判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA）和支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）分析比較紫外光譜、紅外光譜和數(shù)據(jù)融合技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌的區(qū)分效果，構(gòu)建快速、有效鑒別牛肝菌產(chǎn)地的方法，同時(shí)為食品質(zhì)量監(jiān)控提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用5 個(gè)產(chǎn)地絨柄牛肝菌（B. tomentipes Earle.）采自云南省和四川省，所有樣品均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院劉鴻高博士鑒定為絨柄牛肝菌，共96份，樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 牛肝菌樣品信息Table 1 Information about B. tomentipes samples

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀（配備氘化硫酸三甘肽晶體檢測(cè)器） 美國(guó)Perkin Elmer公司；SY3200-T型超聲波清洗儀 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；YP-2型壓片機(jī) 上海市山岳科學(xué)儀器有限公司；FW-100型高速粉碎機(jī) 天津市華鑫儀器廠；80目標(biāo)準(zhǔn)篩盤浙江上虞市道墟五四儀器廠。

1.3 樣品處理和光譜采集

樣品采集后清洗干凈，50 ℃恒溫烘干，粉碎后過80 目標(biāo)準(zhǔn)篩，貯存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱取0.1 g牛肝菌樣品粉末置于試管中，加入10 mL氯仿溶劑，30 ℃條件下超聲提取30 min，3 層濾紙過濾，取清液置于石英比色皿中備用。紫外-可見分光光度計(jì)預(yù)熱30 min后對(duì)樣品提取液進(jìn)行紫外光譜掃描，重復(fù)掃描2 次，取平均光譜，掃描間隔1 nm。掃描前使用氯仿溶液進(jìn)行基線掃描。

按1∶100的比例，準(zhǔn)確稱量（1.5±0.2）mg牛肝菌樣品和（150±20）mg溴化鉀粉末，放入瑪瑙研缽充分混合研磨成細(xì)粉，將細(xì)粉倒入壓制磨具中壓制成厚度均勻的薄片。將紅外光譜儀預(yù)熱30 min后進(jìn)行樣品測(cè)定，樣品重復(fù)測(cè)定2 次，取平均光譜；掃描前使用空白樣本扣除CO2和H2O的干擾。

1.4 數(shù)據(jù)分析

傅里葉變換紅外光譜儀和紫外-可見分光光度計(jì)在采集光譜信息時(shí)，會(huì)受背景噪音、散光等干擾信息[24-25]。為消除無關(guān)信息干擾，紅外原始光譜通過OMNIC 8.0軟件進(jìn)行平均光譜、自動(dòng)基線校正、縱坐標(biāo)歸一化等預(yù)處理，紫外原始光譜采用UV probe 2.34軟件進(jìn)行平滑等預(yù)處理；同時(shí)，采用2D、SNV、MSC和Savitzky-Golay平滑（15 點(diǎn)平滑）分別對(duì)兩種光譜進(jìn)行優(yōu)化處理。

原始光譜經(jīng)預(yù)處理后，選取具有指紋特性的光譜信息進(jìn)行串聯(lián)，形成一個(gè)包含大量變量的獨(dú)立數(shù)據(jù)矩陣，完成低級(jí)融合。采用SIMCA-P＋13.0軟件對(duì)紅外光譜和紫外光譜數(shù)據(jù)分別進(jìn)行PLS-DA，提取特征變量，變量在投影方向的重要程度（variables important in projection，VIP）表示變量對(duì)分類效果的貢獻(xiàn)大小。當(dāng)VIP值大于1時(shí)，表明該值對(duì)應(yīng)的變量對(duì)區(qū)分效果的影響較大，能夠代表樣品的整體信息[26]，整合兩種光譜數(shù)據(jù)的VIP值大于1的波段，進(jìn)行中級(jí)融合。為了消除融合過程中受量綱干擾，在數(shù)據(jù)融合前進(jìn)行歸一化處理。

SIMCA-P＋13.0軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行2D、SNV、MSC、Savitzky-Golay平滑等優(yōu)化處理；Origin 8.0軟件對(duì)圖形進(jìn)行優(yōu)化；通過SIMCA-P＋13.0軟件和MATLAB R2014a軟件分別進(jìn)行PLS-DA和SVM判別分析，建立鑒別模型，比較分類結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜分析

在樣品紫外光譜采集過程中，容易受到溶劑、儀器、環(huán)境等外部因素的干擾，采用UV probe 2.34軟件對(duì)紫外圖譜進(jìn)行平滑等預(yù)處理。由于在190～250 nm波長(zhǎng)內(nèi)干擾嚴(yán)重，400 nm以后無明顯特征吸收峰，且牛肝菌紫外光譜的特征吸收峰集中在250～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，因此選取250～400 nm波段的151 個(gè)變量作為樣品信息用于區(qū)分牛肝菌產(chǎn)地。如圖1所示，在250～400 nm范圍內(nèi)5 個(gè)不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品的光譜圖峰形相似度高，在250～350 nm區(qū)間有明顯的特征吸收峰，265、273、283、295 nm附近為樣品共有峰，表明不同地區(qū)牛肝菌的化學(xué)組分相似。5 個(gè)不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌樣品的峰強(qiáng)、峰位和峰面積存在差異，尤其在250～300 nm區(qū)間差異明顯，具有指紋特性，能夠作為區(qū)分不同地區(qū)絨柄牛肝菌的依據(jù)。

圖1 絨柄牛肝菌平均紅外光譜Fig. 1 Average UV absorption spectra of B. tomentipes

2.2 紅外光譜分析

釆用OMNIC 9.0軟件對(duì)96 份牛肝菌紅外光譜進(jìn)行平滑、基線校正和縱坐標(biāo)歸一化等預(yù)處理。牛肝菌紅外光譜在4 000～400 cm－1波段內(nèi)有明顯的特征吸收峰，具有指紋特性，可以用于牛肝菌的鑒別分析。樣品預(yù)處理后的紅外指紋圖譜如圖2所示，不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌的紅外光譜較為相似，共有峰波數(shù)大致相同，紅外光譜在3 325 cm－1附近的強(qiáng)吸收峰歸屬為蛋白質(zhì)、多糖、纖維素等O—H伸縮振動(dòng)或者是蛋白質(zhì)中N—H伸縮振動(dòng)；2 927 cm－1附近吸收峰主要為多糖、蛋白質(zhì)等甲基對(duì)稱伸縮振動(dòng)；在1 547、1 453、1 402、1 375、1 259、1 081 cm－1及1 029 cm－1等波數(shù)附近有明顯吸收峰，但不同產(chǎn)地樣品的吸收峰強(qiáng)度有差異。1 547 cm－1附近吸收峰為C＝O伸縮振動(dòng)，為蛋白質(zhì)酰胺I帶；1 453 cm－1附近歸屬為亞甲基的彎曲振動(dòng)；1 402、1 375 cm－1及1 259 cm－1等附近為多糖、蛋白質(zhì)等的C—O—H彎曲振動(dòng)和亞甲基的變形振動(dòng)；1 081、1 029 cm－1附近分別為糖類的C—O和C—C伸縮振動(dòng)；1 000～600 cm－1波段有多個(gè)弱吸收峰，主要為糖類異構(gòu)體的特征峰[4,27]。

圖2 絨柄牛肝菌平均紅外光譜Fig. 2 Average FTIR spectra of B. tomentipes

2.3 特征變量提取

通過篩選VIP值得到對(duì)預(yù)測(cè)能力貢獻(xiàn)大的變量，是一種常用的提取潛在變量方法，光譜技術(shù)結(jié)合VIP篩選已經(jīng)在食品鑒別分析方面得到廣泛應(yīng)用[28-29]。采用SIMCA 13.0軟件紫外光譜和紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA，對(duì)紫外光譜和紅外光譜分別進(jìn)行2D＋Savitzky-Golay平滑（15 點(diǎn)平滑）和2D＋SNV＋MSC優(yōu)化處理，并提取VIP值大于1的波段。圖3和圖4中a、b分別代表預(yù)處理后光譜指紋圖譜和VIP值大于1的波段，由圖3a和圖4a可知，經(jīng)預(yù)處理后，圖譜的特征吸收峰更加明顯，圖譜平滑，噪音減?。粓D3b和圖4b表示該波段對(duì)鑒別絨柄牛肝菌產(chǎn)地具有較大貢獻(xiàn)，可以代表牛肝菌整體化學(xué)信息，選取對(duì)應(yīng)的變量作為特征變量進(jìn)行中級(jí)融合。

圖3 預(yù)處理后紫外光譜VIP得分圖Fig. 3 Scores plot for VIP of UV spectra after preprocessing

圖4 預(yù)處理后紅外光譜VIP得分圖Fig. 4 Scores plot for VIP of IR spectra after preprocessing

2.4 PLS-DA

光譜技術(shù)結(jié)合PLS-DA法已被廣泛應(yīng)用于飲料、食用油等食品檢測(cè)和質(zhì)量評(píng)價(jià)[30-32]。采用PLS-DA對(duì)絨柄牛肝菌產(chǎn)地進(jìn)行鑒別分析，隨機(jī)選取32 個(gè)絨柄牛肝菌樣品（約樣品量的1/3）作為預(yù)測(cè)集，其余64 個(gè)樣品作為訓(xùn)練集。對(duì)紫外光譜、紅外光譜、初級(jí)融合和中級(jí)融合數(shù)據(jù)分別建立PLS-DA判別模型。如表2所示，紅外光譜、紫外光譜、初級(jí)融合和中級(jí)融合數(shù)據(jù)級(jí)分別建立PLSDA模型，對(duì)絨柄牛肝菌產(chǎn)地的預(yù)測(cè)正確率為56.25%、56.25%、62.50%和81.25%。紫外光譜和紅外光譜技術(shù)對(duì)未知產(chǎn)地牛肝菌的分類效果相同，且紫外光譜技術(shù)建立模型更加穩(wěn)定。初級(jí)數(shù)據(jù)融合技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地牛肝菌的分類正確率高于單獨(dú)的紫外光譜技術(shù)和紅外光譜技術(shù)，表明初級(jí)融合技術(shù)豐富了光譜數(shù)據(jù)，獲得了更加完整的光譜信息，增加了分類正確率。中級(jí)數(shù)據(jù)融合訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的正確率分別達(dá)到98.44%和81.25%，正確率高于單一光譜技術(shù)，分類效果優(yōu)于初級(jí)融合，表明中級(jí)融合技術(shù)建立的判別模型比單獨(dú)光譜技術(shù)和初級(jí)融合技術(shù)更穩(wěn)定、可靠。

數(shù)據(jù)集來源 正確率/%訓(xùn)練集 預(yù)測(cè)集紅外光譜 92.19 56.25紫外光譜 93.75 56.25初級(jí)融合 93.75 62.50中級(jí)融合 98.44 81.25

2.5 SVM分析

SVM判別模型在材料鑒別[33]、食品分析[34]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在本研究中，SVM建模選取訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的方法同2.4節(jié)，基于紅外光譜、紫外光譜、低級(jí)融合和中級(jí)融合數(shù)據(jù)分別建立SVM判別模型。如圖5所示，4 種方法分別有3、11、4、1 個(gè)樣品區(qū)分錯(cuò)誤，表明紫外光譜技術(shù)建立SVM模型對(duì)絨柄牛肝菌產(chǎn)地鑒別效果最差，中級(jí)融合技術(shù)建立SVM模型對(duì)絨柄牛肝菌產(chǎn)地分類效果最佳。

圖5 SVM對(duì)測(cè)試集的實(shí)際分類和預(yù)測(cè)分類Fig. 5 Actual and SVM predicted categories of the test set samples

訓(xùn)練集正確率代表模型的穩(wěn)定性和可靠性，預(yù)測(cè)集正確率代表模型對(duì)不同產(chǎn)地牛肝菌的區(qū)分效果。如表3所示，產(chǎn)地預(yù)測(cè)正確率分別為90.63%、65.63%、87.50%和96.88%。此外，4 個(gè)數(shù)據(jù)集建模的訓(xùn)練集正確率皆為96.88%，表明4 個(gè)模型的穩(wěn)定性高；初級(jí)融合對(duì)不同產(chǎn)地的預(yù)測(cè)正確率高于單個(gè)紫外光譜技術(shù)，低于單獨(dú)的紅外光譜技術(shù)，表明初級(jí)融合豐富了光譜數(shù)據(jù)，同時(shí)簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)串聯(lián)將無效信息相互疊加，降低分類正確率；中級(jí)融合的分類正確率高于初級(jí)融合，證明中級(jí)融合在整合數(shù)據(jù)過程中去除了無效信息，避免兩種光譜信息的互相干擾，提高分類正確率。比較表2和表3可知，采用中級(jí)融合技術(shù)建立SVM判別模型，模型穩(wěn)定、可靠，對(duì)不同產(chǎn)地牛肝菌鑒別效果最佳。

表3 SVM對(duì)不同數(shù)據(jù)集的分類結(jié)果Table 3 Prediction accuracy of SVM based on different data matrixes

3 結(jié) 論

采用紅外光譜法和紫外光譜法采集不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌的光譜信息，選擇2D＋Savitzky-Golay平滑（15 點(diǎn)平滑）和2D＋SNV＋MSC預(yù)處理方法分別對(duì)樣品紅外光譜和紫外光譜進(jìn)行優(yōu)化處理，減少噪音干擾。對(duì)優(yōu)化后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行初級(jí)融合，并通過PLS-DA提取VIP大于1的波段進(jìn)行中級(jí)數(shù)據(jù)融合。通過PLS-DA和SVM判別分析分別建立分類鑒別模型，并比較紅外光譜、紫外光譜、低級(jí)融合和中級(jí)融合技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌的鑒別效果。結(jié)果顯示：中級(jí)數(shù)據(jù)融合建立PLS-DA和SVM判別模型對(duì)未知樣品產(chǎn)地的預(yù)測(cè)正確率分別為81.25%、96.88%，鑒別效果優(yōu)于其他技術(shù)，表明中級(jí)融合對(duì)不同產(chǎn)地牛肝菌區(qū)分效果最佳，且SVM判別模型與PLS-DA模型相比更加穩(wěn)定、可靠。中級(jí)融合技術(shù)結(jié)合SVM建立鑒別模型，能夠準(zhǔn)確、有效區(qū)分不同產(chǎn)地絨柄牛肝菌，為快速鑒別野生食用菌提供有效方法，對(duì)食品評(píng)價(jià)具有重要意義。

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