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        考馬斯亮藍(lán)法測定復(fù)方白及乳膏中植物蛋白的含量

        2018-04-20 11:30:10陶平德陳芳通訊作者雷敏常明泉陳林
        醫(yī)藥前沿 2018年13期
        關(guān)鍵詞:馬斯亮乳膏光度

        陶平德陳芳(通訊作者)雷敏常明泉陳林

        (1十堰市太和醫(yī)院 湖北 十堰442008)(2湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院學(xué)生 湖北 十堰442000)

        復(fù)方白及乳膏是太和醫(yī)院2013年立項(xiàng)資助的科研項(xiàng)目,也是該院2016年立項(xiàng)的前沿技術(shù)項(xiàng)目。該乳膏以白及溶膠[1]為主藥,加基質(zhì)經(jīng)乳化而成, 具有清除皮膚自由基、軟化角質(zhì)、促進(jìn)細(xì)胞生長、抗氧化、保濕潤膚的功效,用于治療干性皮炎、皮膚皸裂、黃褐斑,也可用于魚鱗病、銀屑病的輔助治療[2-3]。

        復(fù)方白及乳膏能使黃褐斑減退并抑制其生長,可能與其含有一定量的植物蛋白有關(guān),前期,筆者以白及多糖為指標(biāo),對(duì)該乳膏的質(zhì)量控制、體外釋放度等內(nèi)容做過一些相關(guān)研究,為進(jìn)一步明確其活性成份和藥理作用,更好的控制復(fù)方白及乳膏質(zhì)量、為開展后續(xù)研究奠定基礎(chǔ),作者試驗(yàn)用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)其中的植物蛋白含量進(jìn)行檢測。

        1.儀器及試藥

        1.1 儀器

        TU-1901型分光光度儀(北京普析通通用儀器有限責(zé)任公司);BCD-610W型冰箱(博西華家用電器有限公司,功率:1.07KW);KM-410C型超聲震蕩儀(廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司,40KHZ);WGA-UNI-10型超純水器(北京普析通儀器有限責(zé)任公司,功率:300W);FA-2004型電子分析天平(上海精密儀器有限公司,精度0.0001g);MH-1000型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司,300W);試管架(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司,13×50);玻璃試管(20mL、10mL)。

        1.2 試藥

        復(fù)方白及乳膏(太和醫(yī)院生產(chǎn),批號(hào):20170322,20170410,20170416);牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào)140619-201622,包裝規(guī)格23.5mg/瓶);考馬斯亮藍(lán)G250(成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司,CBB,批號(hào)6401-58-1);無水乙醇(武漢市中天化工有限責(zé)任公司,批號(hào)20161225,分析純);85%磷酸(武漢市中天化工有限責(zé)任公司,批號(hào)20161212,分析純);NaCl(沈陽試劑廠,批號(hào)2016010599,含量95~100.05%,基準(zhǔn)試劑);純化水(太和醫(yī)院新鮮生產(chǎn))。

        2.方法與結(jié)果

        2.1 溶液的制備

        (1)0.15mol·L-1Nacl溶液。精密稱取0.4387gNaCl于50mL容量瓶中,加純化水溶解,定容,即得。(2)考馬斯亮藍(lán)溶液。精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-25050mg溶于25mL乙醇中,加入85%磷酸50mL,混合,加純化水稀釋至500mL,即得。(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。精密稱取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10mg,置10mL容量瓶中,加純化水溶解,定容,即得1.0mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)照品儲(chǔ)備液,置冰箱中低溫保存(4℃),取該溶液0.2mL于試管中,加0.15mol·L-1Nacl溶液至2.0mL,加入考馬斯亮藍(lán)溶液10.0mL,混勻,在室溫放置5min,即得。(4)供試品溶液。精密稱取復(fù)方白及乳膏0.25g于燒杯中,加無水乙醇約20mL,超聲溶解,過濾至50mL容量瓶中,用無水乙醇洗滌燒杯3次(每次約8mL),集中濾液,用無水乙醇定容,取該溶液0.6mL于試管中,加0.15mol·L-1Nacl溶液至2.0mL,加入考馬斯亮藍(lán)溶液10.0mL,混勻,放置5min,即得。(5)空白溶液的制備。精密吸取純化水2mL于試管中,加入考馬斯亮藍(lán)溶液10.0mL混勻,在室溫放置5min,即得。

        2.2 測定波長的選擇

        分別取“2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、供試品溶液和空白樣品溶液,在分光光度儀上于500~700nm波長處掃描,記錄掃描圖,結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液、供試品溶液均在595nm處均有最大吸收,空白樣品溶液在此波長處無吸收,選擇595nm為測定波長,掃描圖見圖1。

        圖1 紫外掃描圖

        2.3 曲線方程的建立

        分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下濃度為1.0mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備溶液0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL于10mL試管中,每管加0.15mol·L-1Nacl溶液至1.0mL,混勻,各取0.1mL于對(duì)應(yīng)編號(hào)的新試管中,分別加入考馬斯亮藍(lán)溶液5.0mL混勻,室溫放置5min,即得毎mL含標(biāo)準(zhǔn)蛋白為3.92μg、7.84μg、11.76μg、15.69μg、19.61μg的溶液,取各溶液分別在595nm波長處測定吸收度,以濃度為橫坐標(biāo),吸收度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得曲線方程為y=0.036x-0.0005,r=0.9995,標(biāo)準(zhǔn)蛋白在3.92μg·mL-1~19.61μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

        2.4 精密度試驗(yàn)

        取“2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,以相應(yīng)試劑為空白,在595nm波長處連續(xù)測定5次,記錄吸光度值,結(jié)果RSD為0.77%。表明儀器精密度良好。

        2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取“2.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在595nm波長處分別于0,1,3,6h測定吸光度,記錄吸光度值,結(jié)果RSD為1.89%,表明標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

        平行精密稱取復(fù)方白及乳膏0.25g于試管中,共5份,按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備樣品溶液,以相應(yīng)試劑為空白,在595nm波長處測定吸光度,計(jì)算含量,結(jié)果RSD為1.34%。

        2.7 回收率試驗(yàn)

        精密稱取已測知含量的復(fù)方白及乳膏(批號(hào)20170410)0.125g共9份,毎3份為1組,分別按樣品含量的80%、100%、120%加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液,以相應(yīng)試劑為空白,在595nm波長處測定吸光度,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。

        表1 復(fù)方白及乳膏中植物蛋白回收率實(shí)驗(yàn)表(n =9)

        2.8 含量測定

        精密稱取復(fù)方白及乳膏0.25g(批號(hào)為20170322,20170410,20170416)于燒杯中,每個(gè)批號(hào)各3份,按“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,以相應(yīng)試劑為空白,在分光光度儀上于595nm處分別測定吸收度,計(jì)算含量,結(jié)果見表2。

        表2 復(fù)方白及乳膏中植物蛋白含量測定結(jié)果(n=3)

        3.討論

        考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色,與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合后呈藍(lán)色,在595nm波長處有最大吸收,在一定范圍內(nèi),蛋白質(zhì)與染色劑的結(jié)合量與測定波長的吸光度值成正比,因而采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定復(fù)方白及乳膏中的植物蛋白含量。在制備供試品溶液時(shí),曾使用純化水、10%NaL溶液、乙醇-氯仿(1:1)混合液做乳膏的溶劑,超聲處理,對(duì)液體分別應(yīng)用離心、過濾等方法,但效果都不理想,而采用無水乙醇做溶劑,則溶解效果好,溶解速度快,所制備的溶液澄清,檢出效果良好。作者曾考慮到植物蛋白在酸、堿、丙酮、乙醇中會(huì)受到影響。是否因?yàn)橹参锏鞍妆砻嬗幸粚永w維膜,對(duì)氨基酸結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用?值得進(jìn)一步驗(yàn)證探討。

        復(fù)方白及乳膏中的蛋白屬于植物蛋白,成份比較復(fù)雜,里面不僅有多糖、植物蛋白,還有植物色素等物質(zhì),植物色素可能也產(chǎn)生一定的光密度值,所以在配制樣品時(shí)應(yīng)使蛋白質(zhì)濃度在0.1mg.mL-1以內(nèi),必要時(shí)適當(dāng)增加考馬斯亮藍(lán)染色液的用量,以保證與蛋白質(zhì)染色反應(yīng)完全,克服其它成份對(duì)蛋白質(zhì)測定產(chǎn)生的影響。酸堿對(duì)植物蛋白的測定會(huì)有一定影響,配制檢測溶液時(shí)加入0.15mol·L-1NaCl溶液稀釋,可緩沖其影響。在測定實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)把本實(shí)驗(yàn)所用器具用鉻酸鉀清潔液浸泡、用純化水清洗干凈,并避免使用石英吸收池,防止用具不潔對(duì)測定結(jié)果產(chǎn)生干擾,每次測定完畢用乙醇清洗比色皿,然后用純化水清洗,以免考馬斯亮藍(lán)染色液在比色皿上存在殘留。

        【參考文獻(xiàn)】

        [1]李玲,常明泉.天然高分子復(fù)方白及乳膏的制備及質(zhì)量控制[J].海峽藥學(xué),2015,27(1):51-53.

        [2]何秀麗,陳林,常明泉,等.復(fù)方白及乳膏治療手足皸裂的療效觀察[J].2013,21(6):648-650.

        [3]黃漢陵,汪移林,王剛.自制復(fù)方白及乳膏治療Ⅲ型足部皸裂86例療效觀察[J].山東醫(yī)藥,2014,53(31):105-106.

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