朱斌斌 高 彬 趙清振 徐義國 吳 祥 桂 煜

隨著近幾年人口老齡化速度的加快以及人們生活方式的改變，缺血性腦血管疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，該病具有較高的致殘率和病死率，對患者的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅［1］。目前，臨床上對于缺血性腦血管疾病的治療手段相對較少，效果也較為有限，其治療的原則為盡早恢復(fù)缺血區(qū)的血液灌流，但部分患者再灌注后組織功能并未得到恢復(fù)，反而使結(jié)構(gòu)和功能障礙進(jìn)一步加重，造成了缺血再灌注損傷［2］。研究證實，大腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展與醛類應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及炎癥應(yīng)激等具有密切的關(guān)系，其成為治療缺血性腦血管疾病的重要靶點［3］。ω-3魚油脂肪乳劑具有一定的抗氧化、抗炎癥以及減少血栓形成的作用，國外有報道稱其對大鼠的腸缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，但對腦缺血性再灌注損傷是否有保護(hù)作用尚缺乏研究［4］。因此，本研究觀察了ω-3魚油脂肪乳劑對大鼠腦局灶性缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討了其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組以及藥物干預(yù) SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠40只，體重150～200g，購自中科院上海實驗動物中心。置于溫度（22±1）℃，濕度（60±10）%，光照（12h照明，12h黑暗交替）環(huán)境下飼養(yǎng)1周，自由飲水、普通顆粒飼料喂養(yǎng)。將40只大鼠隨機(jī)分成5組，每組各8只：正常組（C組）、模型組（M組）、ω-3魚油脂肪乳劑5d組（FOFE-5組）、ω-3魚油脂肪乳劑10d組（FOFE -10組）、ω-3魚油脂肪乳劑10d組（FOFE -15組）。C組和M組大鼠不做任何藥物干預(yù)處理，F(xiàn)OFE-5組、FOFE -10以及FOFE -15組分別在手術(shù)前5d、10d、15d開始給予ω-3魚油脂肪乳劑尾靜脈注入，劑量為2ml/（kg·次·d）。

1.2 動物模型建立與評價 M組、FOFE-5、FOFE-10、FOFE -15組采用 Zea Longa線栓方法［5］建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）：術(shù)前12h大鼠禁食，自由飲水。采用10%水合氯醛腹腔麻醉，取仰臥位，頸部正中作以切口逐層切開，暴露右頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈在頸總動脈與頸外動脈中間備線（不扎緊），動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端，在頸總動脈近分叉處切口，插入與血管直徑相適應(yīng)的線栓，收緊備線，打開動脈夾，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動脈，將 4-0 單絲尼龍線在頸動脈分叉處插入頸內(nèi)動脈，當(dāng)進(jìn)入深度約18mm時，可感到輕微阻力感，可認(rèn)為栓線已阻斷大腦中動脈，停止進(jìn)線，扎緊備線，縫合筋膜和皮膚，術(shù)后給予滴慶大霉素注射液預(yù)防感染，注意保溫使體溫恒定。假手術(shù)組只分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，不結(jié)扎。24h后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，剔除死亡以及神經(jīng)行為學(xué)評分為0分老鼠。

1.3 樣本采集和檢測 （1）神經(jīng)行為評分：手術(shù)后24h，在動物處死前采用 Longa評分改良方法進(jìn)行神經(jīng)行為檢測：未觀察到神經(jīng)損傷癥狀，為0分；懸尾試驗中大鼠不能完全伸展對側(cè)前爪為1分；大鼠的前肢抵抗對側(cè)推力能力下降為2分；大鼠稍微向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為3分；明顯向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為4分；行走時向?qū)?cè)傾倒為5分。（2）腦梗死體積：手術(shù)后24h，將大鼠斷頭處死，獲取腦組織后進(jìn)行TCCA染色，觀察腦組織的梗死體積。（3）丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LHD）水平檢測：將腦組織用PBS均漿制成10%的勻漿液，離心處理取上層清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），嚴(yán)格按照說明書要求測定腦組織中MDA、LHD水平，所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。（4）RTPCR方法檢測腦組織中Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)：將分離出的腦組織按照Trizol RNA 提取試劑盒說明書提取總 RNA，采用紫外吸收法測定A260nm/A280nm的比值，在1.8～2.0之間認(rèn)為RNA純度合格。使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA（濃度為 50ng/μl）。加樣后采用定量 PCR 儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。采用Primer Premier5.0及Oligo6 軟件進(jìn)行引物設(shè)計Nrf2 上游 引 物 ：5'-ATCCTTTGGAGGCAAGACAT-3'， 下 游引 物 ：5'-TCCTGTTCCTTCTGGAGTTG-3'；HO-1 上游引物：5'-CAGAGTTTCTTCGCCAGAGG-3'，下游引物 ：5'-TGAGTGTGAGGACCCATCG-3'；β-actin 上游引物：5'-GCCATGATCGTAGCCATCCA-3'，下游引物5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性 10min，95℃變性 30s，60℃ 30s，72℃延伸1min，共40個循環(huán)。所有目的基因的閾值是與內(nèi)參相比較，通過計算2-ΔΔCt表示基因相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差（Analysis of variance，ANOVA）法；計數(shù)資料采用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為評分和大腦梗死面積 C組大鼠的神經(jīng)行為評分和大腦梗死面積均為0，M組大鼠出現(xiàn)不能完全伸展對側(cè)前爪，或向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈或向?qū)?cè)傾倒等的運(yùn)動障礙，大腦的梗死面積可達(dá)（52.31±9.24）%。FOFE-5組、FOFE-10組以及FOFE-15組大鼠的神經(jīng)行為評分和大腦梗死面積較M組顯著降低，且FOFE-5組明顯高于FOFE-10組和FOFE-15組，差異具有顯著性（P＜0.05）；FOFE-10組和FOFE-15組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠手術(shù)后的神經(jīng)行為評分和大腦梗死體積比較（±s）

表1 各組大鼠手術(shù)后的神經(jīng)行為評分和大腦梗死體積比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與M組比較，#P＜0.05；與FOFE-5組比較，△P＜0.05

組別 神經(jīng)行為評分（分） 大腦梗死體積（%）C組 0.00±0.00 0 M組 4.21±0.82* 52.31±9.24*FOFE-5組 2.81±0.93*# 37.23±8.12*#FOFE-10組 2.32±0.77*#△ 31.21±9.21*#△FOFE-15組 2.27±0.84*#△ 30.44±8.67*#△

2.2 MDA和LHD水平 M組大鼠的MDA、LHD水平較C組顯著升高，F(xiàn)OFE-5預(yù)處理使MDA水平顯著降低，且FOFE-10組和FOFE-15組明顯低于FOFE-5組，差異具有顯著性（P＜0.05）；FOFE-10組和FOFE-15組比較無顯著差異（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠手術(shù)后腦組織中的MDA和LHD水平比較（±s）

表2 各組大鼠手術(shù)后腦組織中的MDA和LHD水平比較（±s）

注：與C比較，*P＜0.05；與M組比較，#P＜0.05；與FOFE-5組比較，△P＜0.05

組別 MDA（U/g） LHD（mmol/g）C組 1.79±0.08 613.27±131.27 M組 3.47±0.81* 924.23±108.12*FOFE-5組 2.53±0.77*# 752.73±114.81*#FOFE-10組 2.32±0.88*#△ 711.27±115.81*#△FOFE-15組 2.28±0.84*#△ 706.44±120.78*#△

2.3 Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量 與C組比較，M組的大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量明顯升高，F(xiàn)OFE-5預(yù)處理組的Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量較M組明顯升高，差異具有顯著性（P＜0.05）；FOFE-10組和FOFE-15組比較無顯著差異（P＞0.05），見表 3。

表3 各組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量（±s）

表3 各組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量（±s）

注：與C比較，*P＜0.05；與M組比較，#P＜0.05

組別 Nrf2 HO-1 C組 0.392±0.017 0.132±0.053 M組 0.537±0.048* 0.271±0.056*FOFE-5組 0.582±0.052*# 0.424±0.046*#FOFE-10組 0.608±0.021*# 0.463±0.057*#FOFE-15組 0.621±0.0754*# 0.462±0.051*#

3 討論

Zea-Longa線栓法是通過線栓將腦動脈的絕大部分血流阻斷，并通過定位栓線定向閉塞與基底節(jié)區(qū)皮質(zhì)層血流，病理過程與缺血性腦卒中具有較好的相似性，且該方法操作簡單，重復(fù)性好，在腦缺血疾病的動物實驗中得到了廣泛的應(yīng)用［6］。為探究ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理對缺血性腦卒中的治療作用，本研究以此法建立了MCAO模型，探究了不同處理時間對大鼠神經(jīng)行為以及大腦梗死面積等的影響，分析了其相關(guān)機(jī)制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M組大鼠的神經(jīng)行為平均評分為（4.21±0.82）分，大腦梗死面積為（52.31±9.24）%，與C組具有顯著差異，說明作者已成功建立MCAO模型。采用ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理后，大鼠的神經(jīng)行為評分和梗死面積均顯著的降低，提示ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)對大腦局灶性缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。而FOFE-5組明顯高于FOFE-10組和FOFE-15組，且FOFE-10組和FOFE-15組比較無顯著差異，說明對大鼠進(jìn)行預(yù)處理10d即可達(dá)到最佳效果。

大量的研究已經(jīng)證實，氧化應(yīng)激在大鼠腦缺血灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。在大鼠發(fā)生血流再灌注時，會促使體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，對缺血損傷區(qū)的不飽和脂肪酸雙鏈結(jié)構(gòu)的生物膜造成破壞，從而損傷周圍細(xì)胞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，誘導(dǎo)或引發(fā)腦組織缺氧。MDA是一種醛類物質(zhì)，是脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物，其可以間接的反映氧自由基的代謝能力以及組織氧化性損傷程度［7］。LDH是神經(jīng)細(xì)胞在受到氧自由基攻擊后發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷而產(chǎn)生的，是評價氧自由基損傷程度的敏感指標(biāo)［8］。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M組大鼠的MDA、LHD水平較C組顯著升高，F(xiàn)OFE-5組預(yù)處理使MDA、LHD水平顯著降低。作者認(rèn)為，ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理通過醛類應(yīng)激介導(dǎo)降低對腦組織的氧化性損傷，對大腦局灶性缺血再灌注起到保護(hù)作用。因此，ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理對腦局灶性缺血再灌注的保護(hù)作用與氧化應(yīng)激具有密切關(guān)系，這與目前大部分的研究結(jié)果是一致的。

Nrf2是一種重要的氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，激活其可以上調(diào)HO-1等蛋白的表達(dá)，減少氧化性損傷［9］。Nrf2/HO-1是調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號通路，在正常機(jī)體中，Nrf2多存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，處于失活狀態(tài)，半衰期較短，一旦激活可迅速經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解。當(dāng)機(jī)體遭受氧化應(yīng)激損傷時，Nrf2會迅速被激活，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核，形成半衰期較長的穩(wěn)態(tài) Nrf2，抵抗機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)；HO-1 作為誘導(dǎo)型酶，廣泛表達(dá)于腦組織中，在腦缺血時呈高表達(dá)狀態(tài)，可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M組大鼠的Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA的表達(dá)量明顯高于M組，而 FOFE-5組預(yù)處理后進(jìn)一步使Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA的表達(dá)量升高。在腦組織發(fā)生局灶缺血性再灌注損傷時，為適應(yīng)缺血缺氧等應(yīng)激刺激，Nrf2/HO-1通路被激活，啟動了抗氧化蛋白 HO-1的表達(dá)，對抗缺血缺氧引起的腦組織損傷［10］。而ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理進(jìn)一步促進(jìn)了Nrf2蛋白的合成，進(jìn)一步激活Nrf2/HO-1通路，發(fā)揮抗氧化作用。因此，ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理對腦局灶性缺血再灌注的保護(hù)作用可能與Nrf2/HO-1通路有關(guān)。

綜上所述，ω-3魚油脂肪乳劑預(yù)處理通過調(diào)節(jié)醛類應(yīng)激介導(dǎo)的氧化應(yīng)激以及Nrf2/HO-1信號通路，對大鼠大腦局灶性缺血再灌注損傷起到了保護(hù)作用，其為臨床缺血性腦卒的治療提供了一種新思路。

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