王文志

摘 要：柚皮細(xì)顆粒樣品經(jīng)石油醚回流脫脂、熱水提取，以葡萄糖為參照品，利用分光光度法測(cè)定沙田柚皮中水溶性多糖的含量。

關(guān)鍵詞：柚子；水溶性多糖；提??；測(cè)定

柚子又名“文旦”，味甘酸、性寒，具有理氣化痰、潤(rùn)肺清腸、補(bǔ)血健脾等功效，能治食少、口淡、消化不良等癥，能幫助消化、除痰止渴、理氣散結(jié)。柚子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，含有非常豐富的蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、維生素以及鈣、磷、鎂、鈉等人體必需的元素，還含有多種活性成分，如柚皮甙、多糖、檸檬苦素、酚酸、香精油等。

目前，對(duì)柚子的研究多針對(duì)其精油、生物黃酮的提取及其抗氧化性能的研究，而國(guó)內(nèi)外有關(guān)柚子皮多糖的提取和測(cè)定的研究鮮見報(bào)道。多糖是以天然產(chǎn)物形式存在的，大多數(shù)是以氫鍵等方式與其他多糖或物質(zhì)聚合在一起，它對(duì)腫瘤、肝炎、心血管、抗衰老等方面有獨(dú)特的生物活性，且細(xì)胞毒性極低，對(duì)柚子皮多糖的提取和性能研究頗具價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)將沙田柚皮細(xì)顆粒經(jīng)石油醚回流脫脂后，采用熱水浸泡法提取柚皮中的多糖，用濃硫酸催化水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物而與苯酚縮合成黃色化合物，利用分光光度法進(jìn)行有效測(cè)定，此方法條件溫和、操作方便，可普遍應(yīng)用于植物水溶性多糖的測(cè)定。

1 原料、儀器和方法

1.1原料

柚子：市售（柚皮顆粒40℃烘箱中烘干）； 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：0.6000 mg/mL；5.0%苯酚溶液；無水乙醇、石油醚（沸程 30～60℃）、丙酮、甲醇、木瓜蛋白酶、濃硫酸、氯仿等均為分析純，濃度>99%，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；2100-型可見光分光光度計(jì)：上海龍尼柯儀器有限公司；80-2 型低速臺(tái)式離心機(jī)：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3方法

1.3.1柚皮多糖的提取

取適量柚皮細(xì)顆粒置于圓底燒瓶中，加入石油醚，40℃回流浸提 2 h，抽濾并揮干濾渣溶劑。然后分別取定量濾渣，以水作為溶劑，采用不同的溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)濾渣進(jìn)行多糖的提取實(shí)驗(yàn)。合并濾液，濃縮至原濾液體積的1/4，加入體積相當(dāng)于溶液體積3倍的95%乙醇，多糖呈絮狀沉淀析出，靜置24 h 后，離心分離（3000～6000 r/min）20min 左右。用適量無水乙醇、丙酮洗滌沉淀多次，烘干即得沙田柚皮粗多糖。

1.3.2粗多糖的純化

提取后的粗多糖中含有蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，利用木瓜蛋白酶法去除這些雜質(zhì)，并對(duì)多糖組分進(jìn)行分級(jí)，以得到多糖精品。將木瓜蛋白酶按蛋白酶∶多糖= 1∶20加入多糖溶液中，70℃下在恒溫磁力攪拌器中保溫5h，加入多糖溶液體積1/5 體積的氯仿，再加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合后劇烈震蕩20～30 min，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復(fù)3次。濃縮、醇沉、洗滌、干燥，得脫蛋白的多糖。

1.3.3多糖的測(cè)定

按照不同體積量準(zhǔn)確移取0.6000 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中定容、搖勻得系列對(duì)照品溶液。然后多次取對(duì)照溶液 2.0 mL 置于 10 mL具塞試管中，加入 4.0%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸4.0 mL搖勻，沸水浴保溫15 min 后放入冷水中冷卻。以試劑空白為參比，選用5 mm比色皿在最大吸收波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每次實(shí)驗(yàn)總糖含量。

2 實(shí)驗(yàn)分析

2.1最佳波長(zhǎng)的選擇

分別吸取一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，進(jìn)行波長(zhǎng)掃描實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，波長(zhǎng)在490nm附近吸收最大，故選擇λmax=490nm處為吸光度測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)上述選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖?？偺橇浚▁）在15 ～ 100.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度（A）呈良好的線性關(guān)系。用最小二乘法進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A = 0.00755x+0.07475，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9992。

2.3提取工藝條件優(yōu)化

2.3.1時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

隨加熱時(shí)間增長(zhǎng)，多糖逐步溶解，但時(shí)間過長(zhǎng)多糖又要分解，實(shí)驗(yàn)得知最佳提取時(shí)間為3h。

2.3.2溫度對(duì)多糖提取率的影響

在不同溫度下，測(cè)定多糖提取率，實(shí)驗(yàn)表明：溫度越高，多糖的提取率越高，但高溫長(zhǎng)時(shí)間熱水浸泡回流提取會(huì)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和生理活性有一定的影響，因此宜選擇90℃來提取多糖。

2.3.3料液比對(duì)多糖提取率的影響

考察料液比為1：20、1：30、1：40多糖的提取率，隨著料液比的增加，多糖提取率也增加。由于提取液在后續(xù)工序中需經(jīng)濃縮，若初期加水量過大會(huì)使后續(xù)工序能耗增加，效率降低，因此宜選取料液比為1：20。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

用一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，周期是30min/次，連續(xù)3h考查其穩(wěn)定性。結(jié)果表明顯色反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫（高于20℃）時(shí)，吸光度A在3 h內(nèi)保持穩(wěn)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.59%。

2.3.5標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的回收率和精密度

平行配制5個(gè)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品。按照前述方法測(cè)定其吸光度、計(jì)算回收率和精密度見表2?；厥章蕿?9.00±1.15%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.594%。

2.3.6多糖含量測(cè)定

分別稱取不同質(zhì)量的干燥柚皮細(xì)顆粒和果肉，按照上述優(yōu)化條件操作提取和純化，再按前面步驟進(jìn)行測(cè)定，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出水溶性多糖含量。經(jīng)過三次測(cè)定的結(jié)果說明，柚皮多糖的平均產(chǎn)率是7.28%，相對(duì)平均偏差是0.82%；柚肉多糖的平均產(chǎn)率卻高達(dá)21.24%，相對(duì)平均偏差為0.56%。

2.3.7柚皮提取前后的微觀表征

未處理過的樣品組織細(xì)胞呈密閉狀態(tài)，表面比較粗糙但有一定的排布規(guī)則。而回流提取3 h后的樣品組織細(xì)胞已呈完全擴(kuò)張狀態(tài)促使有效成分快速溶出。由于溫度和溶劑作用而使組織細(xì)胞發(fā)生劇烈形變，許多細(xì)胞壁已經(jīng)完全破碎并已無法辨認(rèn)，有效成分已經(jīng)完全析出。

3 結(jié)論

（1）經(jīng)過石油醚40℃回流浸提2h脫脂，以熱水浸泡回流，抽濾，濃縮，95%乙醇洗滌，得到呈絮狀沉淀狀的多糖。靜置，離心分離，分別用無水乙醇、丙酮洗滌沉淀多次，烘干即得柚皮粗多糖。其最佳工藝條件是：90℃熱水，對(duì)料液比為1：20的樣品浸泡回流3h。

（2）糖含量在15 ～ 100.0μg/mL范圍內(nèi)與吸光度（A）呈良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.00755x+0.07475，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9992。

（3）柚皮多糖的平均產(chǎn)率是7.28%，相對(duì)平均偏差是0.82%；柚肉多糖的平均產(chǎn)率卻高達(dá)21.24%，相對(duì)平均偏差為0.56%。

（4）柚皮細(xì)胞組織的微觀表征說明，經(jīng)過石油醚脫脂-熱水浸泡回流3h有助于細(xì)胞壁破碎并有利于多糖等活性成分溶出完全。本實(shí)驗(yàn)為沙田柚及其皮的廣泛藥用提供了新技術(shù)。

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