丁洲，李燁昕，袁藝，王海燕，劉學詩，江昌俊,4*

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安徽茶區(qū)優(yōu)良群體種的表型性狀和遺傳多樣性分析

丁洲1，李燁昕2，袁藝3，王海燕1，劉學詩1，江昌俊2,4*

1. 安徽農業(yè)大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；2. 安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036； 3. 安徽農業(yè)大學教務處，安徽 合肥 230036；4. 信陽師范學院河南省茶樹生物學重點實驗室，河南 信陽 464000

安徽省是中國茶葉的重要產區(qū)，種質資源分布廣泛。本研究經過初步篩選后，對選取的10個區(qū)域優(yōu)質群體種的表型性狀進行比較分析，并利用SSR分子標記對這10個不同的群體種進行遺傳多樣性分析，建立不同區(qū)域間親緣關系樹狀圖。這對于充分發(fā)掘和利用豐富的地方群體種種質資源、整合和保護茶樹種質資源、選育優(yōu)良的茶樹新品種具有重要的理論和實踐意義。

安徽茶區(qū)；優(yōu)良群體種；表型性狀；遺傳多樣性

種質資源是茶樹育種的物質基礎，也是茶學領域研究的基礎[1]。安徽省茶葉發(fā)展歷史悠久，品類眾多，茶葉產區(qū)主要分布于長江南北的山區(qū)和丘陵地帶，是國內少有的兼具南北氣候帶特點的重點產茶省。由于其獨特而優(yōu)越的地理環(huán)境，經過長期自然與人工的馴化栽培，在一些地區(qū)形成了品種豐富且具有地方特色的優(yōu)良群體種種質資源。

安徽地區(qū)雖然是茶葉的主要產區(qū)，種質資源分布廣泛，但是在種質資源方面的研究相對落后。據報道其他主要的產茶省都已經進行了詳細的資源普查和種質資源收集，有的茶區(qū)已經建立了種質資源庫[2]。而安徽省茶樹遺傳親緣關系沒有作過科學系統(tǒng)的梳理，尤其是種質資源優(yōu)良的部分茶區(qū)茶種來源不明確。目前除了黃山已經建立的資源庫以外，沒有發(fā)現其他產茶區(qū)有資源庫的建立，這些限制了安徽地區(qū)茶樹品種的發(fā)展與茶葉新品的創(chuàng)新。本研究在經過初步篩選后，對選取的10個地方優(yōu)質群體種種群的分布區(qū)域進行調查研究，對適合制作當地地方名優(yōu)茶的群體種種群的表型性狀進行比較分析，并用SSR分子標記對這10個不同區(qū)域的群體種進行遺傳多樣性分析，建立不同區(qū)域間親緣關系樹狀圖。這對于在無性系良種大范圍普及種植的趨勢下，充分發(fā)掘和利用豐富的地方群體種種質資源，整合和保護茶樹種質資源，選育優(yōu)良的茶樹新品種具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

通過查閱種質資源調查報告、文獻資料與實地調查相結合的方法，篩選出安徽省內10個有當地群體種的重要產茶區(qū)（見表1），確定好采樣的參考指標。于2016年4月根據預定的采樣指標實地選擇3株形態(tài)性狀相近的植株，每株選取次年生成熟葉片量多的枝條，每個采樣點采摘形態(tài)性狀相近的茶樹6~11種，共采摘樣品10組65種，每個種類取部分葉片于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 表型性狀統(tǒng)計方法

內容包括葉長、葉寬、葉著生角、芽葉色澤、芽葉茸毛、芽葉光澤度、葉面隆起性、光澤性、葉色、葉質等，并進行生物統(tǒng)計分析。

1.2.2 DNA的提取和SSR-PCR分析

采用改進的CTAB法提取基因組DNA。50對引物分別參照Zhao等[2]、Kaundun等[3]、金基強等[4]和Yang等[5]的引物編號和序列，對65個茶樹地方優(yōu)良群體種進行SSR-PCR擴增，并采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物的多態(tài)性。

表1 群體種種群地理坐標信息

1.2.3 數據處理

將銀染后的2次PCR電泳圖上均清晰的條帶記為1，將沒有或不易分辨的弱帶記為0，建立原始數據矩陣。SSR位點的多態(tài)性信息量（Polymorphism informationContent，PIC）采用PIC_CALC計算工具進行計算。應用PopGen Ver 1.32軟件計算不同引物的有效位點數（Effective number of alleles，Ne）、He值（Expected heterozygosity）、Ho值（Observed heterozygosity）、Shannon信息指數I、Nei氏期望雜合度[6]。采用NTSYS2.10軟件對供試種質品種進行UPGMA聚類分析，構建樹狀聚類圖[7]。

2 結果與分析

2.1 不同地區(qū)茶樹群體種種群表型性狀綜合分析

對10個調查采樣地區(qū)優(yōu)良群體種表型性狀綜合分析表明（表2），不同采樣區(qū)茶樹的表型性狀存在著豐富的遺傳變異。茶樹的平均葉長為6.57~12.48?cm，平均葉寬為2.89~5.69?cm，平均葉面積為13.66~50.18?cm2。按照小葉種、中葉種、大葉種進行分類，在65份種質資源中，小葉種有21份，中葉種有32份，大葉種有12份。葉形主要是橢圓與長橢圓形，葉色以黃綠、綠為主，芽葉茸毛除少數地區(qū)為中等外，多數茸毛較少，芽葉光澤性基本較強，成熟葉葉色綠，葉面微隆，葉面光澤中等或較強，葉身除黃花山群體種為內折或稍內折外，其他群體種都是表現為背卷與稍內折，隨著緯度的降低，葉質逐漸變硬。

根據茶樹資源的14個形態(tài)特征對10個地區(qū)的材料進行聚類分析，獲得基于表型性狀的親緣關系樹狀圖（圖1），10個地區(qū)的茶樹資源被分為三組：第一組有3個地區(qū)的群體種，包括石婆店群體種、九一六群體種和金雞群體種，它們同屬于六安地區(qū)，主要特點為芽葉茸毛少，葉片大小以小葉為主，葉形呈橢圓形、背卷、柔軟、黃綠色；第二組有4個地區(qū)的群體種，包括石關群體種、汀溪群體種、黃花山群體種和龍眠山群體種，它們分別屬于安慶地區(qū)和宣城地區(qū)，主要特點為芽葉茸毛少，葉片大小以中葉和大葉為主，葉形呈橢圓形、背卷、葉質較硬、綠色；第三組有3個地區(qū)的群體種，包括松蘿群體種、竹鋪群體種、顏家?guī)X群體種，它們同屬于黃山地區(qū)，芽葉茸毛較多，葉片大小以中葉和小葉為主，葉形呈長橢圓形、背卷、葉質較硬、綠色。

圖1 基于表型性狀的10個地區(qū)間茶樹種質資源聚類圖

表2 不同地區(qū)群體種種群形態(tài)學指標測量結果綜合分析

2.2 茶樹的遺傳多樣性綜合分析

用50對引物對65個茶樹地方優(yōu)良群體種進行SSR-PCR擴增（表3），共檢測到等位位點244個，平均每對引物檢測到4.88個，其中最多的為12個（YG13），最少的為2個（A44，A46，A57，YG14）。共檢測到392個基因型，平均每對引物檢測到7.84個基因型，其中最多的為15個（YG13），最少為3個（A44，YG9）。群體內遺傳多樣性分析結果Nei在0.0465~0.7628間變動，平均值為0.4751。群體He值在0.1000（G120）~0.773（G112）之間，平均值為0.4826。Ho值在0.0476（G180）~0.5238（G127）之間，平均值為0.2686。Shannon信息指數（I）值為0.1023（YG3）~1.5363（G112），平均值為0.7869。結果表明65種茶樹群體種資源有較高的遺傳多樣性。

使用NTSYS2.10軟件分析10個地區(qū)間的遺傳相似系數。結果表明：遺傳相似系數在0.9456~0.9865之間，再使用NTSYS2.10軟件對10個地區(qū)間優(yōu)質群體種種群繪制樹狀聚類分析圖（圖2）。

通過244個等位基因對10個地區(qū)茶葉群體種種群間形成的遺傳相似性矩陣的UPGMA聚類分析，可以看出安徽茶區(qū)群體種種群間遺傳相似性極高，遺傳相似系數在0.95時，可以把10個地區(qū)茶葉群體種種群分為三類。第一類包括石關群體種與龍眠山群體種，這兩個群體種種群都位于安慶地區(qū)。第二類分為兩個亞類，第一亞類包括顏家?guī)X群體種、石婆店群體種、金雞群體種、竹鋪群體種、松蘿群體種，其中遺傳相似性最高的是顏家?guī)X群體種與石婆店群體種接近0.99；另一亞類包含九一六群體種與汀溪群體種。第三類是黃花山群體種。由遺傳相似性分析可以得出，本次實驗所調查的10個地區(qū)優(yōu)質群體種種群間遺傳相似性極高，親緣關系近。

3 討論

茶樹表型性狀的區(qū)分是區(qū)別群體種間不同個體的重要方法，也是區(qū)分不同地區(qū)群體種種群形態(tài)學差異大小的重要依據[8]。本試驗中發(fā)現不同地區(qū)茶樹群體種種群表型性狀表現出了不同程度的多樣性。其中，葉長、葉寬、葉面積、葉質變異較大；也有一些性狀的變異程度較低，如葉形、葉色、葉面、葉身、芽葉色澤、芽葉茸毛、芽葉光澤等。其缺點是由自然突變或物化誘變所獲得的具有特定形態(tài)特征的材料，所需時間長且可能產生不穩(wěn)定的性狀，易受環(huán)境條件及基因顯隱性的影響。要更加準確細致地了解群體種的遺傳變異狀況，僅依賴于表型性狀是遠遠不夠的，還必須進行更深層次的研究并加以比較和驗證。

運用分子標記技術研究茶樹地方群體種質的遺傳多樣性，從基因組水平上揭示其遺傳變異的程度，可以不受發(fā)育時期、環(huán)境變化、不同器官等的限制。本研究中使用分子標記技術對這10個地區(qū)的優(yōu)良群體種種群間的親緣關系進行分析，并構建了親緣進化樹狀圖，從分子水平上表明安徽這10個地區(qū)茶葉群體種種群間遺傳相似性極高，為正確評價茶樹種質資源及優(yōu)良品種的選育提供了參考依據。分子標記與形態(tài)標記是兩種不同形式的標記，形態(tài)特征揭示的是基因與環(huán)境互作的差異，而分子標記揭示的是物種DNA序列上的差異。由于不同的聚類分析方法是從不同的水平和角度分析種質間的遺傳差異，所得到的結果可能不是絕對的一致，只有相互結合和印證，才能比較全面地解釋研究結果。

現階段對茶樹的其他育種方法尚在實驗和起步階段，如雜交、誘變、輻照等方法技術并不成熟且代價高，而且由于茶樹的自然生長周期，得到可觀測性狀的試驗周期較長[9]。群體種資源是通過自然雜交，在特定區(qū)域環(huán)境中由自然選育出的有良好生存能力的成熟植株，現在已確立的茶樹良種大多是通過在群體種資源中篩選出來的。地方優(yōu)良群體種資源的收集、保存和保護，可以大幅縮短育種的試驗周期，有效擴大育種材料的遺傳基礎[10]。茶樹種質資源是未來優(yōu)質茶樹選育的基礎，而地方保存完好的優(yōu)質群體種資源就是其中重要的組成部分，如何弄清這些群體種間的差異并進行系統(tǒng)的區(qū)分與鑒定，如何良好地利用這些種質資源為茶樹新品種的有效選育提供條件，還需要找出一個更合理有效的方法。

表3 基于SSR分析的65個茶樹樣品的遺傳多樣性比較

圖2 10個地區(qū)間茶樹種質SSR數據的UPGMA聚類圖

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Phenotypic Traits and Genetic Diversity of Elite Tea Population in Anhui（China）

DING Zhou1, LI Yexin2, YUAN Yi3, WANG Haiyan1, LIU Xueshi1, JIANG Changjun2,4*

1. Life Science College of Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Tea & Food Science and Technology College of Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 3. Academic Affairs Office of Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 4.Henan Key Laboratory of Tea Biology of Xinyang Normal University, Xinyang 464000, China

Anhui is an important tea-producing province in China, with widely distributedtea germplasms. In this study, the phenotypic traits were compared among 10 elite populations after preliminary screening. Subsequently,phylogenetic tree analysis with SSR markers was performed to analyze the genetic diversity of populations in the 10 areas. These results had important theoretical and practical significance for exploration and utilization of the resources, protection of tea germplasm, as well as breeding of superior varieties.

Anhui tea area, elite tea population, phenotypic traits, genetic diversity

S571.1；S330

A

1000-369X(2018)02-155-07

2017-09-04

2017-10-22

安徽農業(yè)大學中青年基金（2014QJ018）、國家自然基金（31700608）、安徽省自然基金（1708085MC58）、安徽省教育廳植物學教學團隊（2014jxtd008）

丁洲，女，講師，主要從事植物學與分子生物學的研究。

jiangcj@ahau.edu.cn