張永恒，萬(wàn)思卿，陳江飛，王偉東，周天山，肖斌，楊亞軍,2*，余有本*

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茶樹、基因的克隆及在非生物脅迫中的響應(yīng)

張永恒1，萬(wàn)思卿1，陳江飛1，王偉東1，周天山1，肖斌1，楊亞軍1,2*，余有本1*

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008

蔗糖非酵解型蛋白激酶（SnRK）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，其中SnRK2家族在植物非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中起著十分重要的作用。為了探究茶樹家族基因響應(yīng)逆境的分子機(jī)制，本研究克隆了兩個(gè)茶樹SnRK2家族基因，并分別命名為（GenBank登錄號(hào)：MG026837）和（GenBank登錄號(hào)：MF662805），生物信息學(xué)分析表明和分別編碼358個(gè)和337個(gè)氨基酸，與擬南芥和玉米SnRK2蛋白激酶的同源性很高，均具有保守的ATP結(jié)合位點(diǎn)和Ser/Thr激酶活性結(jié)構(gòu)域。在高鹽、干旱和ABA脅迫下，均能被誘導(dǎo)表達(dá)，且呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，而在低溫和高溫脅迫下表達(dá)量變化不大；能強(qiáng)烈響應(yīng)高鹽脅迫，也能被高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；表明它們可能與茶樹抗逆密切相關(guān)。

茶樹；SnRK2s；克??；非生物脅迫

蛋白激酶在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的功能，廣泛參與植物細(xì)胞分化、物質(zhì)能量代謝以及逆境響應(yīng)等一系列生理活動(dòng)[1]。蔗糖非酵解型蛋白激酶（Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase，SnRK）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能可分為SnRK1、SnRK2、SnRK3三個(gè)家族[2]，其中SnRK2家族是植物中特有的蛋白激酶，在植物遭受逆境脅迫時(shí)起至關(guān)重要的作用。在玉米[3]、煙草[4]、小麥[5]、葡萄[6]、楊樹[7]等植物中，均廣泛參與了非生物脅迫的響應(yīng)，且其表達(dá)水平與植物的抗逆能力密切相關(guān)[8]。譬如，過(guò)表達(dá)甘蔗的轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性顯著提升[9]，過(guò)表達(dá)楊樹和能大幅度增加擬南芥的耐鹽能力[10]，過(guò)表達(dá)小麥的擬南芥具有抗低溫、高鹽、干旱等多種抗性[11]。

植物應(yīng)答逆境脅迫的過(guò)程十分復(fù)雜，涉及多種信號(hào)通路，根據(jù)是否有ABA參與可分為ABA依賴途徑和ABA非依賴途徑[12]。SnRK2在ABA依賴途徑和ABA非依賴途徑中均發(fā)揮重要調(diào)控作用，如在過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，通過(guò)ABA非依賴途徑，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐旱、耐低溫能力[13]；在干旱條件下能響應(yīng)體內(nèi)ABA信號(hào)，調(diào)控氣孔的關(guān)閉減少失水，增加擬南芥的抗旱能力[14]。目前，SnRK2參與ABA非依賴途徑的分子機(jī)制尚不清楚；而在ABA依賴途徑中，SnRK2蛋白激酶被證實(shí)為核心調(diào)控因子：當(dāng)植物遭受逆境脅迫時(shí)，ABA在細(xì)胞內(nèi)快速積累，ABA受體特異性地感知ABA信號(hào)并與之結(jié)合，形成ABA-PYR/PYL/ RCAR復(fù)合體，該復(fù)合體進(jìn)一步與A型PP2C結(jié)合，促使SnRK2激酶與PP2C分離，SnRK2的活性得以釋放?；钚誀顟B(tài)下的SnRK2蛋白激酶能激活下游轉(zhuǎn)錄因子ABF/AREB或離子通道，誘導(dǎo)ABA應(yīng)答基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物抵抗逆境的能力[15-17]。

茶樹是我國(guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，近年來(lái)部分茶區(qū)低溫、干旱等極端天氣頻發(fā)，茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重受損，比如，2013年夏天罕見(jiàn)的高溫干旱使浙江省13.86萬(wàn)hm2茶園遭受危害，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到17.2億元[18]。所以探究茶樹的抗逆機(jī)制，培育新型抗逆茶樹品種迫在眉睫。然而，與其他植物相比，茶樹非生物脅迫方面的研究還比較薄弱，迄今還未見(jiàn)關(guān)于茶樹家族基因功能的研究報(bào)道。本研究克隆了兩個(gè)茶樹家族基因，并分析了它們?cè)诙喾N脅迫下的表達(dá)模式，以期為深入研究基因在茶樹非生物脅迫中的響應(yīng)機(jī)制提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理方法

試驗(yàn)材料為培養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)科研溫室的一年生龍井長(zhǎng)葉茶樹品種水培茶苗，培養(yǎng)條件為白天25℃，晚上22℃，自然光照；選取生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)一致的茶苗分別用ABA（100?μmol·L-1），NaCl（200?mmol·L-1），20% PEG 6000，4℃，38℃處理；ABA處理時(shí)，先將ABA溶于少量95%乙醇，然后用蒸餾水配制成終濃度為100?μmol·L-1的溶液，均勻噴灑在水培茶苗葉片上，在處理后0、2、4、8、12、24?h時(shí)從至少3株茶苗幼嫩枝條頂端分別取2~3片幼嫩葉片混合后分成3份；PEG和NaCl處理時(shí)，向培養(yǎng)液中加入固體PEG和NaCl，攪拌至完全溶解后，將茶苗的根部完全浸沒(méi)在培養(yǎng)液中進(jìn)行鹽脅迫和模擬干旱處理，在處理后0、2、4、8、12、24?h時(shí)按照ABA處理后同樣的方法進(jìn)行取樣；高溫、低溫處理在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定值時(shí)迅速將水培茶苗移至光照培養(yǎng)箱中，在處理后0、2、4、8、12、24?h時(shí)按照ABA處理后同樣的方法進(jìn)行取樣。另采集多株未處理水培茶苗的根、莖、葉和花等組織，所有樣品液氮速凍后保存于–80℃，用于提取RNA。

1.2 SnRK2基因的克隆

采用CTAB法提取茶樹葉片總RNA[19]，–80℃保存。cDNA第一鏈合成按照5×All-In-One RT MasterMix試劑盒（abm，加拿大）說(shuō)明書進(jìn)行。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)基因特異性引物（表1），以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增條件為：94℃、5?min；94℃、30?s，59℃、30?s，72℃、100?s，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，目的片段按照PCR純化試劑盒Gel Extraction Kit（OMEGA，美國(guó)）進(jìn)行回收，連接到pMDTm19-T Vetor（TAKARA，大連寶生物），然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，挑選陽(yáng)性單克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI中的ORF finder進(jìn)行ORF的查找和編碼氨基酸的推導(dǎo)；用ProtParam tool進(jìn)行蛋白相對(duì)分子量及理論等電點(diǎn)的分析，用NetPhos 3.1 Server進(jìn)行蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；用ProtScale分析疏水性，用WoLF PSORT進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，用DNAMAN7.0進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA7.0進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

表1 引物序列

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

2 結(jié)果分析

2.1 基因克隆及序列分析

以龍井長(zhǎng)葉茶樹葉片cDNA為模板，用特異性引物F/R和F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到長(zhǎng)度為1?373?bp（圖1-A）和1?164?bp（圖1-B）的片段；測(cè)序結(jié)果表明，這兩條序列與本課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，將兩條序列提交到NCBI，登錄號(hào)分別為MG026837（）和MF662805（）。ORF finder分析表明的ORF框?yàn)??077?bp，編碼358個(gè)氨基酸；的ORF框?yàn)??014?bp，編碼337個(gè)氨基酸。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 同源比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

將和的ORF序列在NCBI中分別進(jìn)行BLASTX比對(duì)，結(jié)果表明它們都屬于SnRK2家族，并且與其他物種的SnRK2家族成員具有高度的相似性，其中與葡萄SRK2A（XP_002269221.1）、蘋果SnRK2.9（NP_001306943.1）、馬鈴薯SnRK2.4（NP_001274892.1）、煙草SRK2A（NP_001312448.1）等物種的SnRK2成員相似性均高達(dá)90%以上；與木薯SAPK2（XP_021600376.1）、麻風(fēng)樹SAPK2（XP_012067903.1）等物種的SnRK2成員相似性也分別達(dá)到87%和85%。

注：M. marker, A. CsSnRK2.1擴(kuò)增產(chǎn)物，B. CsSnRK2.2擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2進(jìn)化分析

圖3 茶樹CsSnRK2.1和CsSnRK2.2與其他植物SnRK2s的氨基酸序列比對(duì)

將和的氨基酸序列與擬南芥和水稻SnRK2家族成員的氨基酸序列在MEGA7.0中采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明與Group 1成員AtSnRK2.10和AtSnRK2.4聚在一簇，與Group 2成員AtSnRK2.8聚在一簇（圖2），表明它們分別屬于Group 1和Group 2家族，對(duì)比它們的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它們?cè)贜端相似性很高，均含有保守的ATP結(jié)合位點(diǎn)DXGXGNFGVAXL和Ser/Thr激酶活性結(jié)構(gòu)域（活化環(huán)）KICDFGYSKSXXXHGXPK（圖3）。

2.2.2 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

SnRK2s蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，因此其活性受到絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化調(diào)控。在NetPhos 3.1 Server中對(duì)兩個(gè)蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，兩個(gè)蛋白中均含有大量的磷酸化位點(diǎn)。有磷酸化位點(diǎn)29個(gè)，其中絲氨酸位點(diǎn)14個(gè)，蘇氨酸位點(diǎn)9個(gè)，酪氨酸位點(diǎn)6個(gè)（圖4-A）；有磷酸化位點(diǎn)27個(gè)，其中絲氨酸位點(diǎn)15個(gè)，蘇氨酸位點(diǎn)6個(gè)，酪氨酸位點(diǎn)6個(gè)（圖4-B）。

2.2.3和蛋白親水/疏水性分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

用ProtScale結(jié)合ProtParam tool對(duì)和進(jìn)行親水/和疏水性分析，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，和均為親水蛋白，其中的平均疏水系數(shù)為–0.608，在191和192號(hào)氨基酸位置出現(xiàn)最大親水系數(shù)2.189，在335號(hào)氨基酸位置出現(xiàn)最小親水系數(shù)–3.5（圖5-A）；而平均疏水系數(shù)為–0.275，同樣在191和192號(hào)氨基酸位置出現(xiàn)最大親水系數(shù)，而最小親水系數(shù)則出現(xiàn)在40號(hào)氨基酸位置（圖5-B）。另外，WoLF PSORT中亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)定位于胞質(zhì)骨架上，而定位到細(xì)胞質(zhì)中。

圖4 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.3 茶樹不同組織中CsSnRK2.1和CsSnRK2.2的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明，在嫩葉中表達(dá)量最高，其次是根，在花中表達(dá)量最低；而在根和葉片表達(dá)量相當(dāng)且最高，其次是花，在莖中表達(dá)量最低（圖6）。

2.4 非生物脅迫對(duì)CsSnRK2.1和CsSnRK2.2的表達(dá)分析

熒光定量PCR法分析了非生物脅迫后兩個(gè)基因表達(dá)水平的變化情況，結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，兩個(gè)基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)模式有較大差異。

2.4.1 NaCl脅迫對(duì)茶樹基因表達(dá)的影響

從圖7-A中可以看出，NaCl處理后，和的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，峰值均出現(xiàn)在2?h時(shí)左右；但各時(shí)間段的表達(dá)水平明顯高于，且在8?h后就降至正常值，而仍然穩(wěn)定在處理前2倍左右。

圖5 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2蛋白親/疏水性分析

注：誤差線表示3次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2.4.2 溫度脅迫對(duì)茶樹基因表達(dá)的影響

從圖7-B和圖7-C中可以看出，高溫（38℃）脅迫24?h內(nèi)，的表達(dá)量沒(méi)有較大變化，而的表達(dá)量在8?h開(kāi)始上升，12?h達(dá)到處理前2.5倍左右，然后又回落到處理前水平；低溫脅迫后，的表達(dá)量呈先升后降趨勢(shì)，4?h表達(dá)量最高，約為脅迫前的2.5倍左右，而對(duì)低溫似乎不敏感，僅在4?h時(shí)小幅上調(diào)。

注：誤差線表示3次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差

2.4.3干旱脅迫和ABA處理對(duì)茶樹基因表達(dá)的影響

用20% PEG6000處理模擬干旱脅迫后，的表達(dá)量在24?h內(nèi)都比較穩(wěn)定，而的表達(dá)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，8?h達(dá)到峰值，約為處理前6倍左右（圖7-D）。

從圖7-E可知，ABA處理后，的表達(dá)不能被誘導(dǎo)，的表達(dá)量在2?h時(shí)上升至處理前的2.5倍左右，然后逐漸下降，12?h恢復(fù)到處理前水平。

3 討論

SnRK2是植物響應(yīng)非生物脅迫的關(guān)鍵調(diào)控因子[8]，對(duì)它的研究有利于進(jìn)一步揭示植物抗逆機(jī)制。目前SnRK2家族成員功能的研究主要集中在擬南芥、水稻、玉米等模式植物，而茶樹SnRK2家族成員的功能及其分子機(jī)制還有待研究。本研究從茶樹品種中克隆得到了兩個(gè)SnRK2基因，它們編碼的氨基酸序列與其他物種的SnRK2成員具有較高同源性，尤其是N端的ATP結(jié)合位點(diǎn)和活化環(huán)區(qū)域。目前已經(jīng)鑒定出了很多SnRK2的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)，如擬南芥AtSnRK2.6[21]活化環(huán)中的Ser175，AtSnRK2.10[22]活化環(huán)中的Ser158，它們與激酶活性密切相關(guān)。和活化環(huán)內(nèi)的158位氨基酸均為Ser，與AtSnRK2.10一致，表明和的激酶活性可能也與Ser158密切相關(guān)。

已有的研究表明SnRK2家族基因廣泛參與植物的逆境響應(yīng)過(guò)程[11,23-24]。本研究的結(jié)果亦證實(shí)和與茶樹的逆境響應(yīng)密切相關(guān)。在鹽脅迫下，和的表達(dá)量均出現(xiàn)先升高后降低的變化，說(shuō)明它們參與了茶樹對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)；而的表達(dá)量始終高于，表明它們對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)程度不同，這與馬鈴薯[25]、棉花[26]等作物中的研究結(jié)果相同；另外，擬南芥中和均被證實(shí)在鹽脅迫下能維持根部的生長(zhǎng)及穩(wěn)定性[27]，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明與和親緣關(guān)系最近，推測(cè)在鹽脅迫下也可能與茶樹根部的生長(zhǎng)相關(guān)。植物體內(nèi)往往有多個(gè)基因能被PEG激活，但它們響應(yīng)PEG的快慢及受誘導(dǎo)程度有很大區(qū)別[28-29]。本研究中能迅速、強(qiáng)烈且持續(xù)地被PEG誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表明它在茶樹應(yīng)對(duì)干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，的表達(dá)量在24?h時(shí)上升至處理前2倍，但24?h后其表達(dá)量變化情況還有待進(jìn)一步研究。和受低溫誘導(dǎo)后都僅在4?h時(shí)上調(diào)表達(dá)，而在煙草[4]、小麥[30]等作物中與低溫密切相關(guān)的基因都被持續(xù)誘導(dǎo)，說(shuō)明茶樹中和很可能不是響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵基因。在高溫脅迫下，的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，表明它不響應(yīng)高溫脅迫；而的表達(dá)量出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，與玉米[31]在高溫脅迫下的表達(dá)趨勢(shì)相同，推測(cè)它可能參與了茶樹對(duì)高溫的響應(yīng)過(guò)程。

SnRK2參與非生物脅迫的信號(hào)通路可以分為ABA依賴途徑和ABA非依賴的兩種途徑[12]。Kobayashi等[15]研究表明10個(gè)水稻成員均受到高滲透脅迫的誘導(dǎo)，但只有Group 3亞家族成員（、和）能被ABA誘導(dǎo)；擬南芥的10個(gè)SnRK2成員中也只有Group 3亞家族成員（、和）能被ABA強(qiáng)烈激活[32]。本研究中和分別屬于Group 1、Group 2亞家族；ABA處理24?h內(nèi)，的表達(dá)量始終沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明它可能與小麥[11]、煙草[24]等作物中Gorup 2亞家族成員一樣，主要是通過(guò)ABA不依賴途徑參與植物抗逆反應(yīng)；而能被ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，與擬南芥、水稻的研究結(jié)果不一致，但楊樹[7]中Gorup 1亞家族成員基因也能被ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明家族基因Group 1亞家族成員對(duì)ABA的響應(yīng)可能具有物種特異性。然而茶樹是否參與了ABA依賴的信號(hào)途徑、其分子機(jī)制如何仍不清楚，這將是后期的研究重點(diǎn)。

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Cloning and Expression Analysis ofandGenes in Tea Plant () under Abiotic Stress

ZHANG Yongheng1, WANG Siqing1, CHEN Jiangfei1, WANG Weidong1, ZHOU Tianshan1, XIAO Bin1, YANG Yajun1,2*, YU Youben1*

1. College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Tea Research Institute of Chinese Academy, Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase (SnRK) is a kind of serine/threonine protein kinases widely exist in plants. Among them, members of SnRK2 family play a vital role in plant response to stresses. In order to investigate the molecular mechanisms ofin response to abiotic stresses, twogenes from tea plant were cloned and named as(GenBank accession code: MG026837) and(GenBank accession code: MF662805) respectively. Bioinformatics analysis showedthat they contained 358 and 337 amino acids respectively, which harbored a conserved ATP binding site and Ser/Thr kinase domain and were highlysimilar to SnRK2 protein kinase ofand maize. The expression ofwas transiently induced and then decreased by high salinity (100?mmol·L-1NaCl), drought (20% PEG6000) and ABA(100?μmol·L-1) stress, but showed no significant changes under low (4℃) or high temperature treatments (38℃).By contrast,was strongly induced by high salt and temperature treatments. The results revealed thatandmight be closely related to stress responses in tea plant.

tea plant (), SnRK2s, cloning, abiotic stress

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)02-183-10

2017-06-05

2017-08-01

國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、漢中綜合試驗(yàn)站（CARS-23）、陜西省農(nóng)業(yè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（tg2015-099）、中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016M602873）

張永恒，男，碩士研究生，主要從事茶樹分子育種研究。