郭冰玉，回薔，常鵬，陶凱

（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院整形外科，沈陽 110840）

黑色素瘤是較為常見的皮膚腫瘤，雖然早期發(fā)現(xiàn)可以通過手術(shù)的方法進(jìn)行治療，但是黑色素瘤極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，通常發(fā)現(xiàn)時(shí)就已經(jīng)累及多個(gè)器官，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移患者預(yù)后極差［1-4］。

PAK5是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員之一，在胰腺癌、胃癌、腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，在黑色素瘤中也有一定的促癌作用［5］。miR-489在諸如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤中都被發(fā)現(xiàn)具有低表達(dá)的現(xiàn)象，體外實(shí)驗(yàn)［6-8］證實(shí)其可以在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長和遷移能力，但是在黑色素瘤中鮮有報(bào)道。

本研究擬探討miR-489通過打靶PAK5來抑制黑色素瘤的遷移功能的方式，旨在為黑色素瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375 （我科實(shí)驗(yàn)室凍存） ，DMEM培養(yǎng)基 （美國HyClone公司） ，胎牛血清 （天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司） ，miR-489 擬似物 （CATGAGGGCAGAAACCGATGCAA） ，miR-489抑制物 （GTTGCATCGGTTTCTGCCCTCATG） （廣州銳博生物科技有限公司），臺(tái)盼藍(lán) （上海碧云天生物技術(shù)有限公司） 。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：使用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人黑色素瘤細(xì)胞A375，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2 熒光素酶報(bào)告基因：在使用lipo2000轉(zhuǎn)染PAK5 WT和PAK5 MUT （突變PAK5與miR-489的結(jié)合位點(diǎn)） 后，分別將空白對(duì)照、miR-489和miR-489的反義鏈轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)所有質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥有限公司。轉(zhuǎn)染24 h后使用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)測得熒光值。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于Transwell小室中，終體積200 μ L，下室加入600 μ L無血清培養(yǎng)基，12 h后更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞共分3組，分別為空白對(duì)照組，miR-489擬似物組和miR-489抑制物組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。通過lipo2000轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，棉簽擦去上層細(xì)胞，95%乙醇固定20 min，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色20 min。200倍顯微鏡下觀察。

1.2.4 Western blotting：不同因素處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞通過裂解得到蛋白。取等量蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳。90～110 V電泳2 h、4 ℃下100 V轉(zhuǎn)膜1 h，洗膜，5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h，對(duì)應(yīng)一抗4 ℃晃動(dòng)孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，洗膜后ECL發(fā)光儀發(fā)光。PAK5和GAPDH抗體以及相關(guān)二抗均購自美國SANTA公司。

1.2.5 實(shí)時(shí)PCR：不同因素處理細(xì)胞24 h后，1 mL Trizol裂解細(xì)胞，加0.2 mL氯仿，振搖15 s，室溫靜置2～3 min。離心15 min。吸取上層水相，加入0.5 mL異丙醇，混勻。離心10 min棄上清。加入75 %乙醇，振搖。離心5 min干燥后，用DEPC處理水溶解沉淀，55～60 ℃孵育10～15 min。將得到的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所用引物為PAK5，F(xiàn) （5’-3’） ：TCTGGACCTCTGAGACCATG，R（5’-3’） ：GTGTTCAAAGTTGGACGGGC；GAPDH，F(xiàn)（5’-3’） ：CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，R （5’-3’） ：GCGCCCAATACGACCAAATC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)的比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-489對(duì)A375細(xì)胞遷移的影響

在A375細(xì)胞中過表達(dá)miR-489或者將miR-489下調(diào)后，使用Transwell的方法檢測miR-489對(duì)A375細(xì)胞的遷移影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-489過表達(dá)后可以顯著抑制A375細(xì)胞的遷移作用，反之，當(dāng)miR-489下調(diào)后，A375細(xì)胞的遷移受到促進(jìn)，見圖1。

2.2 miR-489對(duì)PAK5的靶向作用

圖1 miR-489對(duì)A375細(xì)胞遷移的影響 ×200Fig.1 Effect of miR-489 on migration of A375 cells ×200

通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-489可以打靶A375細(xì)胞中PAK5并抑制其表達(dá)，見圖2。

2.2 miR-489對(duì)PAK5的影響

在A375細(xì)胞中分別將miR-489過表達(dá)或者抑制miR-489表達(dá)24 h后，通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，miR-489過表達(dá)可以顯著抑制A375細(xì)胞中PAK5的表達(dá)，反之，當(dāng)miR-489受到抑制后，PAK5的表達(dá)有所上升，見圖3。

隨后通過實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)檢測了當(dāng)miR-489過表達(dá)或受到抑制后，PAK5的mRNA水平的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-489過表達(dá)可以顯著抑制PAK5的表達(dá)，反之，當(dāng)miR-489受到抑制后，PAK5的表達(dá)有所上升，見圖4。

圖2 miR-489可以打靶PAK5Fig.2 miR-489 can target PAK5

3 討論

miR-489在多種腫瘤中被報(bào)道存在低表達(dá)的現(xiàn)象，它可以通過抑制AKT的表達(dá)來抑制卵巢癌的進(jìn)程；可以通過打靶PTPN11來抑制口腔內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長遷移；也具有抑制膀胱癌、胃癌和腸癌細(xì)胞的存活與侵襲的能力。由此可見，miR-489也可能對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能有一定影響［7-9］。

圖3 Western blotting檢測miR-489對(duì)A375細(xì)胞中PAK5蛋白水平的影響Fig.3 PAK5 expression in A375 cells after treatment with miR-489 mimic /inhibitor detected by Western blotting

圖4 實(shí)時(shí) PCR檢測miR-489對(duì)A375細(xì)胞PAK5 mRNA水平的影響Fig.4 PAK5 expression in A375 after treatment with miR-489 mimic /inhibitor detected by real-time PCR

PAK5在多數(shù)癌癥，如結(jié)腸癌、前列腺癌以及口腔鱗狀細(xì)胞癌中均有普遍的基因擴(kuò)增現(xiàn)象存在。研究［10］發(fā)現(xiàn)，PAK5激酶在胃癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、膽囊癌和絨毛膜癌等多達(dá)78%的腫瘤組織或細(xì)胞中過表達(dá)。PAK5通常通過對(duì)信號(hào)通路和細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)與控制來實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的多樣化調(diào)控。在信號(hào)通路方面，PAK5可通過HGF/LIMK1/cofilin通路、MEK-1/ERK1/2/MMP2通路等來影響腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移［10］，由此可見，PAK5的靶向治療對(duì)腫瘤的防治具有重要意義。

本研究首先發(fā)現(xiàn)miR-489具有抑制黑色素瘤遷移的功能，這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示著miR-489可能參與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展，可能會(huì)成為黑色素瘤治療的潛在靶點(diǎn)。隨后通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-489可以顯著抑制PAK5的活性，由此推斷miR-489對(duì)黑色素瘤細(xì)胞遷移功能的抑制可能在一定程度上是由于其抑制PAK5活性導(dǎo)致的。進(jìn)一步通過蛋白水平和RNA水平的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-489可以顯著抑制PAK5的表達(dá)。因此推斷miR-489可能通過打靶PAK5來抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移。

本研究指出，miR-489可以通過抑制PAK5蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抑制黑色素瘤細(xì)胞遷移的作用，這為黑色素瘤的治療提供了新的方向。

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