陳麗　鄔劍　秦玉寶　唐鷺　蘇欣　張艷

耐藥結(jié)核病、特別是耐多藥結(jié)核病是目前我國結(jié)核病控制領(lǐng)域的最大難題[1]。耐藥結(jié)核病是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌經(jīng)體外藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)證實對一種及以上的抗結(jié)核藥物耐藥，耐多藥結(jié)核病是指結(jié)核分枝桿菌同時對利福平(RFP)和異煙肼(INH)耐藥。藥敏試驗在耐藥結(jié)核病的診斷和指導治療過程中起著重要作用。本研究對389例涂陽肺結(jié)核患者的痰標本進行RFP和 INH的直接法固體藥敏試驗，并與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗結(jié)果做對比，分析直接法固體藥敏試驗對耐藥結(jié)核病診斷的臨床應用效果。

材料和方法

一、材料來源

1.標本來源：收集2010年2月至2011年7月就診于黑龍江省五常市和雙城市兩個結(jié)核病實驗室的389例經(jīng)痰涂片抗酸染色鏡檢確定為涂陽肺結(jié)核患者的痰標本。初治患者標本301例，復治患者標本88例。

2.培養(yǎng)基來源：直接法藥敏試驗所需培養(yǎng)基有酸性羅氏培養(yǎng)基、含40.0 μg/ml RFP的酸性羅氏培養(yǎng)基、含0.2 μg/ml INH的酸性羅氏培養(yǎng)基；比例法藥敏試驗所用的培養(yǎng)基有中性羅氏培養(yǎng)基、40.0 μg/ml RFP含藥培養(yǎng)基、0.2 μg/ml INH含藥培養(yǎng)基；菌種鑒別用0.5 mg/ml的對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基均為本實驗室自制。酸性羅氏培養(yǎng)基、中性羅氏培養(yǎng)基、PNB培養(yǎng)基、比例法RFP含藥培養(yǎng)基，以及INH含藥培養(yǎng)基的制作方法按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[2]。直接法藥敏培養(yǎng)基的制作方法為以酸性羅氏培養(yǎng)基為原液，分別加入相應含量的RFP、INH溶液，制成含RFP 40.0 μg/ml的酸性羅氏培養(yǎng)基、含INH 0.2 μg/ml的酸性羅氏培養(yǎng)基。

二、研究方法

痰標本抗酸染色鏡檢、直接法痰標本分枝桿菌固體培養(yǎng)、比例法分枝桿菌藥敏試驗均嚴格按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[2]規(guī)范操作。

1. 涂陽痰標本：萋-尼染色鏡檢法確定涂陽痰標本。

2. 直接法固體藥敏試驗：視痰標本性狀，將1～2倍體積的4% NaOH加入有痰標本的前處理管內(nèi)，旋緊處理管螺旋蓋，計時15 min，渦旋振蕩30 s直至痰標本液化，室溫靜置至15 min計時結(jié)束，用無菌吸管吸取前處理后的痰標本，分別均勻接種于酸性羅氏培養(yǎng)基(直接法藥敏的對照培養(yǎng)基)、含40 μg/ml RFP的酸性羅氏培養(yǎng)基(直接法RFP培養(yǎng)基)、含0.2 μg/ml INH的酸性羅氏培養(yǎng)基(直接法INH培養(yǎng)基)，每支管接種0.1～0.15 ml。在36 ℃ 條件下進行孵育。每周在登記本上記錄所有培養(yǎng)基上菌落的生長情況，直至第8周。

耐藥性的判斷方法分兩種：耐藥百分比判斷法和菌落數(shù)判斷法。耐藥百分比判斷法為以對照培養(yǎng)基上有菌落生長為前提，含藥培養(yǎng)基生長的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基生長的菌落數(shù)>1%判定為耐藥，否則為敏感；對照培養(yǎng)基上無菌落生長的標本不納入本次評價。菌落數(shù)判斷法為以對照培養(yǎng)基上有菌落生長為前提，含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)多于20個判斷為該藥耐藥，否則為敏感。

3. 比例法藥敏試驗和菌種鑒定：用酸性羅氏培養(yǎng)基上分枝桿菌培養(yǎng)陽性的菌株，做傳統(tǒng)比例法藥敏試驗和PNB培養(yǎng)基生長試驗，試驗方法和結(jié)果判讀依照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[1]。

4. 統(tǒng)計學分析：應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計算直接法固體藥敏試驗的各檢測效能指標，各項指標計算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總檢測人數(shù)×100%。一致性比較采用Kappa檢驗，Kappa≥0.75表示兩者一致性較好。不同方法檢測陽性率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

結(jié)　　果

1.檢測結(jié)果：直接法藥敏試驗的389例涂陽患者痰標本培養(yǎng)時對照管培養(yǎng)基發(fā)生污染3例，涂陽培陰15例，獲得分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株371例，經(jīng)PNB培養(yǎng)基鑒別為NTM的3例，MTB 的368例；比例法藥敏試驗的371例陽性分離株試驗時有20例因污染等原因無法判讀耐藥性結(jié)果；直接法RFP藥敏試驗有5例因污染未獲得藥敏試驗結(jié)果，直接法INH藥敏試驗有13例因污染未獲得藥敏試驗結(jié)果。剔除因污染、涂陽培陰等原因無法獲得藥敏試驗結(jié)果的標本，最終兩種方法均獲得RFP藥敏試驗結(jié)果的346例，均獲得INH藥敏試驗結(jié)果的338例，可供分析菌株包含3株NTM菌株。

2.RFP耐藥性檢測結(jié)果：兩種方法檢測346例涂陽患者痰標本的對RFP藥敏試驗的結(jié)果見表1。比例法檢測的RFP耐藥率為13.9%(48/346)。當直接法固體藥敏試驗結(jié)果以>1%作為耐藥界限時，檢測的RFP耐藥率為10.4%(36/346)，兩種方法檢測耐藥率的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=24.14，P<0.01)。以比例法藥敏試驗結(jié)果為標準，直接法固體藥敏試驗對RFP進行耐藥檢測的敏感度、特異度、一致率、陽性預測值、陰性預測值分別為75.0%(36/48)、82.9%(247/298)、81.8%(283/346)、41.4%(36/87)、95.4%(247/259)，兩種方法檢測結(jié)果的一致性一般(Kappa=0.43)。

當直接法固體藥敏試驗結(jié)果以20個菌落為耐藥界限時，檢測的RFP耐藥率為10.4%(36/346)，與比例法檢測耐藥率的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.87,P<0.01)。以比例法藥敏試驗結(jié)果為標準，直接法固體藥敏試驗對RFP耐藥檢測的敏感度、特異度、一致率、陽性預測值、陰性預測值分別為75.0%(36/48)、86.2%(257/298)、84.7%(293/346)、46.8%(36/77)、95.5%(257/269)，兩種方法檢測結(jié)果的一致性一般(Kappa=0.49)。

3.INH耐藥檢測結(jié)果：兩種方法檢測338例涂陽患者痰標本的INH藥敏試驗結(jié)果見表2。比例法檢測的INH耐藥率為10.9%(37/338)。當直接法固體藥敏試驗結(jié)果以>1%作為耐藥界限時，檢測的INH耐藥率為7.1%(24/338)，兩種方法檢測耐藥率的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.29，P<0.01)。

表1　比例法藥敏試驗與直接法固體藥敏試驗檢測RFP耐藥結(jié)果的比較(例)

表2　比例法藥敏試驗與直接法固體藥敏試驗檢測INH耐藥結(jié)果的比較(例)

以比例法藥敏試驗結(jié)果為標準，直接法固體藥敏試驗對INH耐藥檢測的敏感度、特異度、一致率、陽性預測值、陰性預測值分別為64.9%(24/37)、86.0%(259/301)、83.7%(283/338)、36.4%(24/66)、95.2%(259/272)，兩種方法檢測結(jié)果的一致性一般(Kappa=0.39)。

當直接法固體藥敏試驗結(jié)果以20個菌落為耐藥界限時，檢測的INH耐藥率為7.1%(24/338)，與比例法檢測耐藥率的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.38，P<0.01)。以比例法藥敏試驗結(jié)果為標準，直接法固體藥敏試驗對INH耐藥檢測的敏感度、特異度、一致率、陽性預測值、陰性預測值分別為64.9%(24/37)、88.7%(267/301)、86.1%(291/338)、41.4%(24/58)、95.4%(267/280)， 兩種方法檢測結(jié)果的一致性一般(Kappa=0.43)。

討　　論

目前我國結(jié)核病實驗室對于耐藥結(jié)核病診斷常規(guī)實驗室檢測主要是細菌學固體藥敏試驗，包括直接法和間接法，間接法的比例法藥敏試驗是1996世界衛(wèi)生組織在我國開展耐藥監(jiān)測以來廣泛在結(jié)核病實驗室應用的方法[3]，已被公認為耐藥結(jié)核病診斷的金標準，而直接法固體藥敏試驗的應用效果近年來鮮有報導。筆者對比分析389例涂陽肺結(jié)核患者的痰標本對RFP和INH進行的直接法固體藥敏試驗與傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗結(jié)果，認為直接法固體藥敏試驗與痰標本分離培養(yǎng)同時進行，無需額外特殊處理，操作相對簡單，與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗用培養(yǎng)陽性菌株做試驗相比可能存在優(yōu)勢，但從兩種方法檢驗結(jié)果分析來看，直接法固體藥敏試驗結(jié)果與比例法藥敏試驗結(jié)果存在一定差距。

本研究結(jié)果顯示，直接法藥敏試驗無論采用哪種耐藥界限，耐藥率檢測結(jié)果均低于比例法。直接法分別以>1%為耐藥檢測界限和20個菌落生長作為耐藥檢測界限時檢測的RFP的耐藥率均為10.4%，低于比例法檢測RFP耐藥率(13.9%)，且兩種方法檢測結(jié)果的一致性一般(Kappa值分別為0.43和0.49)。直接法分別以>1%為耐藥檢測界限和20個菌落生長作為耐藥檢測界限時檢測INH的耐藥率均為7.1%，低于比例法檢測的INH耐藥率(10.9%)，且兩種方法檢測結(jié)果的一致性一般(Kappa值分別為0.39和0.43)。陽性預測值上表現(xiàn)的差別更為明顯：直接法藥敏試驗以>1%作為耐藥檢測界限時，對RFP和INH耐藥檢測的陽性預測值分別為41.4%和36.4%；以20個菌落生長作為耐藥檢測界限時，對RFP和INH耐藥檢測的陽性預測值分別為46.8%和41.1%。至于2種方法的一致率稍好(都在80%以上)，考慮主要是敏感菌株所占比例較大所致。另外，本研究也存在一定局限性，如樣本數(shù)量過小，以及進行痰樣本直接法藥敏試驗時，未增加噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)、PNB和28 ℃ 培養(yǎng)基對菌種作同步鑒別，由此會對本研究的結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

綜上所述，筆者認為直接法固體藥敏試驗對于耐藥結(jié)核病檢測的臨床意義不大，其檢測結(jié)果不可作為耐藥結(jié)核病和耐多藥結(jié)核病的診斷依據(jù)。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2017.Geneva: World Health Organization,2017.

[2] 趙雁林, 逄宇. 結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2015.

[3] 張賀秋, 趙雁林. 現(xiàn)代結(jié)核病診斷技術(shù). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2013: 199-200.