胡東昊 王喬新 劉鳳云 謝金枝 李偉宏

(1 焦作職工醫(yī)學(xué)院， 焦作 454150； 2 鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 鄭州 450064)

近年來(lái)，隨著各種惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率的增高[1]，腫瘤的免疫治療得到更廣泛的關(guān)注，研究的熱點(diǎn)也更傾向于開(kāi)發(fā)新型腫瘤疫苗[2]。多肽疫苗作為一個(gè)很有潛力的腫瘤疫苗已經(jīng)應(yīng)用于各種腫瘤的免疫治療中[3]。多肽疫苗在原有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)能力的基礎(chǔ)上也有新的進(jìn)展，多表現(xiàn)在增強(qiáng)多肽疫苗抗腫瘤效應(yīng)的策略方面。如提高CTL表位的免疫原性，與T輔助表位的聯(lián)用，增加多肽的長(zhǎng)度，克服HLA分子限制性等[4]。一些臨床實(shí)驗(yàn)表明，與最小CTL表位單肽疫苗相比，用長(zhǎng)肽進(jìn)行疫苗接種能夠改善特異性CTL應(yīng)答[5]。CTNNA2屬于癌睪抗原(cancer testis, CT)抗原，是與經(jīng)典鈣黏蛋白相關(guān)的細(xì)胞骨架組分連環(huán)蛋白家族的成員。其功能與細(xì)胞黏附有關(guān)，同時(shí)它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡化程度相關(guān)[6]。CTNNA2在正常組織中僅僅表達(dá)于睪丸和腦組織，而在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中都有顯著的表達(dá)[7]。本研究選擇CTNNA2進(jìn)行預(yù)測(cè)并設(shè)計(jì)長(zhǎng)肽進(jìn)行免疫學(xué)活性實(shí)驗(yàn)，旨在為腫瘤多肽疫苗候選效果更好的長(zhǎng)肽。

1 材料和方法

1.1 材料

MCF-7由實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，采用37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。T2A2細(xì)胞:轉(zhuǎn)染HLA-A*0201分子的TAP缺陷T2細(xì)胞系，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLA-A2+健康供者捐贈(zèng)。HLA-A2+外周血健康供者來(lái)自尋找的健康供者。

1.2 設(shè)計(jì)長(zhǎng)肽疫苗及HLA-A2限制性CTL表位肽的合成

首先對(duì)癌睪抗原CTNNA2進(jìn)行HLA-A2限制性CTL表位肽的預(yù)測(cè)，使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件NetCTL 1.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)[8]、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHC Server.dll/Epitope Prediction.htm)[9]和BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)[10]軟件對(duì)CTNNA2氨基酸序列的預(yù)測(cè)打分，CTL表位限制性MHC類型HLA-A*02。預(yù)測(cè)抗原肽長(zhǎng)度(nonamers 9aa)。目的抗原 CTNNA2 的氨基酸序列參照NCBI(NP_001269526.1)所提供的序列。根據(jù)集中的HLA-A2限制性CTL表位設(shè)計(jì)CTNNA2抗原來(lái)源的長(zhǎng)肽，共獲得3條長(zhǎng)肽，分別為CTNNA2 P129-156、P778-800、P857-880。候選肽由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)反相高效液相色譜法分析純化后，其純度大于95%，經(jīng)電噴霧質(zhì)譜法鑒定相對(duì)分子質(zhì)量符合理論值。

1.3 PBMCs分離

準(zhǔn)備50 ml離心管，預(yù)先加肝素鈉，預(yù)防血凝。抽取外周血20 ml或40 ml，加入等體積的PBS混勻；將淋巴細(xì)胞分離液4 ml 加入到15 ml 離心管中，緩慢注入PBS與血液的混合液8 ml；常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，2 000 r/min離心20 min后，用彎管將上層血清抽掉，再輕輕抽取白膜層；按PBS：白膜層細(xì)胞>5∶1的比例，洗滌白膜層，2 000 r/min離心15 min，收集白膜層細(xì)胞；用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)。

1.4 樹(shù)突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)

按上述方法分離得到PBMCs，10%胎牛血清IMDM培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)2×106/ml，每孔2 ml 分至6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；將未黏附的細(xì)胞洗脫，抽取液體及未貼壁的細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，在6孔板里加入溫?zé)岬腎MDM培養(yǎng)基2 ml，加入IMDM培養(yǎng)基2 ml，并補(bǔ)加粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)(100 ng/ml)、白細(xì)胞介素4(IL-4)(50 ng/ml)；于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；2 d半量換液1次，并補(bǔ)加GM-CSF(100 ng/ml)、IL-4(50 ng/ml)；培養(yǎng)至第5天加入脂多糖(LPS)(100 ng/ml)，誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)成熟；48 h后收集細(xì)胞[11]。

1.5 DC荷肽實(shí)驗(yàn)

收集成熟的DC，無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基充分洗滌，重懸計(jì)數(shù)1×106/ml；加入長(zhǎng)肽20 μg/mL，培養(yǎng)4h；收集細(xì)胞，用無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基洗滌1次；重懸計(jì)數(shù)，加入50～100 μg的絲裂霉素C，加入20 μg/ml的長(zhǎng)肽，培養(yǎng)1 h；10%已滅活的胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)2×105/ml；取PBMCs，重懸計(jì)數(shù)2×106/ml，荷肽的DC作為刺激細(xì)胞，兩者各取0.5 ml加入24孔板；隔日添加rIL-2(50 U/ml)，每3 d半量換液，并補(bǔ)加rIL-2；1周后收集細(xì)胞，以10∶1的比例與新鮮制備的荷肽DC共培養(yǎng)，進(jìn)行第2輪刺激；第3次刺激后的第3天收集細(xì)胞，用于后續(xù)活性實(shí)驗(yàn)[12]。

1.6 IFN-γ分泌水平的檢測(cè)

取出酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT，購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)板條，加200 μl無(wú)血清的IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，靜置10 min；將前期誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，每孔加50 μl，荷肽的DC作為刺激細(xì)胞，補(bǔ)加40 μl的無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基，設(shè)立對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔；37℃、5% CO2孵育18 h；傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μl無(wú)菌的去離子水，4℃裂解細(xì)胞10 min；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μl 1×washing buffer 洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μl生物素標(biāo)記的抗體，37℃孵育1 h；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μl 1×washing buffer進(jìn)行洗滌，方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μl酶聯(lián)親和素，37℃孵育1 h；每孔加入200 μl 1×washing buffer進(jìn)行洗滌，方法同上；加入100 μl現(xiàn)配的AEC顯色液，25℃避光靜置30 min；結(jié)束后置于通風(fēng)處，室溫靜置干燥；結(jié)果用 ELISPOT 圖像分析儀計(jì)數(shù) 96 孔板中每孔的斑點(diǎn)數(shù)。

1.7 CFSE熒光染色檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)離心收集靶細(xì)胞，并將細(xì)胞重懸于含有1% FCS的PBS中，并將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×106/ml。致敏靶細(xì)胞：每1 ml細(xì)胞懸浮液加入0.5 μl 15 mmol/L羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxy fluorescein succinimidyl ester, CFSE)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，室溫，光照孵育4 min。對(duì)照靶細(xì)胞：每1 ml細(xì)胞懸液中加入0.5 μl 100 μmol/L CFSE，室溫，光照孵育4 min。將細(xì)胞用5% FCS-PBS洗滌1次，離心并除去上清液，將細(xì)胞重懸于無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應(yīng)細(xì)胞(前期誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞)在無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基中洗滌1次，并以 1.25×106～5×106細(xì)胞/ml的濃度重懸于無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應(yīng)細(xì)胞(分別為12.5∶1、25∶1、50∶1)與致敏的靶細(xì)胞在離心管中混合，靶細(xì)胞數(shù)為 2×104，最終體積并在37℃溫育4 h孵育后，用含有1% FCS及0.1%疊氮化鈉的PBS(FACS)處理相同的E：T致敏的靶細(xì)胞組和對(duì)照靶細(xì)胞組，并用FACS洗滌。離心，重懸在4%多聚甲醛的PBS溶液中，流式細(xì)胞儀在機(jī)器檢測(cè)。殺傷率=(對(duì)照樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量-測(cè)試樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量)/對(duì)照樣品中致敏靶細(xì)胞的數(shù)量×100%。

1.8 LDH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞濃度 2×106/ml；調(diào)整靶細(xì)胞MCF-7細(xì)胞濃度為1×105/ml，每孔加50 μl，即為5 000個(gè)/孔；按設(shè)置的效靶比加入效應(yīng)細(xì)胞及各種對(duì)照組，每孔終體積為100 μl；37℃、CO2孵育箱中孵育4 h，孵育結(jié)束前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放組和體積校正組中各加入10 μl裂解液；離心孔板，1 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清50 μl至96孔板中；每孔加入50 μl乳酸脫氫酶底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔加入50 μl終止液；在酶標(biāo)儀上設(shè)置490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收值。殺傷率計(jì)算：靶細(xì)胞殺傷率(%)=[(實(shí)驗(yàn)組吸光值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組吸光值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放組吸光值)/(靶細(xì)胞最大釋放組吸光值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放組吸光值)]×100%[13]。

1.9 細(xì)胞因子染色法檢測(cè)T細(xì)胞釋放IFN-γ水平

誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的DC作為刺激細(xì)胞；陰性對(duì)照孔每孔加入1×106/ml的效應(yīng)細(xì)胞，終體積為1 ml；陽(yáng)性對(duì)照孔每孔加入1×106/ml的效應(yīng)細(xì)胞和100 μl PHA再補(bǔ)加900 μl無(wú)血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入阻斷劑BFA 5 μg/ml到培養(yǎng)體系中，充分混勻。于培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2孵育4 h；孵育結(jié)束后，1 500 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞，用含2% FBS溶液的PBS將細(xì)胞重懸。避光加入細(xì)胞表面抗體，4℃避光孵育20 min，1 500 r/min，離心5 min。用細(xì)胞染色溶液洗滌2次，收集細(xì)胞，每孔加入100 μl破膜劑，4℃孵育20 min。收集細(xì)胞，加入抗IFN-γ抗體，4℃避光孵育30 min；每管加入500 μl細(xì)胞染色溶液，重懸，轉(zhuǎn)移到Falcon圓底試管中上機(jī)檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CTNNA2在腫瘤組織中的表達(dá)情況

使用The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)查詢CTNNA2在腫瘤病人組織中的表達(dá)情況，從數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)果得知CTNNA2在肝癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌中均有表達(dá)。如圖1所示。

圖1 腫瘤組織中CTNNA2的表達(dá)Fig 1 Expression of CTNNA2 in tumor tissue

2.2 CTNNA2 HLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測(cè)以及長(zhǎng)肽的設(shè)計(jì)

預(yù)測(cè)CTNNA2蛋白開(kāi)放閱讀框中潛在的HLA-A2超型限制性CTL表位，依據(jù) NetCTL1.2、SYFPEITHI和BIMAS軟件的結(jié)果，選取在各個(gè)預(yù)測(cè)軟件中分值排名靠前的表位肽。設(shè)計(jì)長(zhǎng)肽的長(zhǎng)度盡量選擇包含已經(jīng)預(yù)測(cè)的較好的9個(gè)氨基酸的肽段。所設(shè)計(jì)的長(zhǎng)肽長(zhǎng)度大概25個(gè)氨基酸左右。具體打分情況以及設(shè)計(jì)長(zhǎng)肽結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFN-γ分泌水平

志愿者的PBMCs經(jīng)過(guò)GM-CSF和IL-4的誘導(dǎo)及LPS的刺激，成為成熟的DC。DC荷載長(zhǎng)肽刺激PBMCs 3輪后，ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)能分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量。與PBS組相比，P129-156、P778-800、P857-880這3條長(zhǎng)肽在志愿者中均誘導(dǎo)出了可以分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞(圖2)。

2.4 LDH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

體外ELISPOT實(shí)驗(yàn)顯示，3條長(zhǎng)肽在志愿者中均能誘導(dǎo)分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這3條長(zhǎng)肽特異性的CTL對(duì)靶細(xì)胞是否有殺傷，選擇MCF-7作為靶細(xì)胞(CTNNA2+，HLA-0201+)進(jìn)行LDH實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示(圖3)，當(dāng)效靶比是50∶1時(shí)，P778-800、P857-880在志愿者中所誘導(dǎo)的CTL對(duì)靶細(xì)胞MCF-7的殺傷率分別為28.5%、35.2%。P129-156在志愿者中所誘導(dǎo)的CTL對(duì)靶細(xì)胞MCF-7的殺傷率較低，數(shù)據(jù)中并沒(méi)有顯示，圖3中只顯示了效果較好的2條長(zhǎng)肽P778-800、P857-880。

表1 CTNNA2抗原HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測(cè)結(jié)果Tab 1 Prediction scores of the peptide derived from CTNNA2

圖2 ELISPOT 檢測(cè)長(zhǎng)肽在HLA-A2健康志愿者中誘導(dǎo)的CTLs的IFN-γFig 2 In long peptide-pulsed DC assay, IFN-γ release assayed by ELISPOT using long peptide-pulsed DC to induce CTLs from HLA-A2 healthy donor

圖3 長(zhǎng)肽誘導(dǎo)的CTL在不同效靶比時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷情況Fig 3 Specific lysis of MCF-7 by the CTLs induced by synthetic long peptide

2.5 CFSE熒光染色檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

候選肽所誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL隨著效靶比的提高殺傷效果相應(yīng)提到。根據(jù)LDH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將效果較好的P778-800、P857-880進(jìn)一步的使用CFSE熒光染色檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)；P778-800、P857-880 2條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比(12.5∶1、25∶1、50∶1)時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷情況見(jiàn)圖4。P778-800、P857-880 2條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率分別是26.5%±1.86%和33.6%±1.26%，而陰性對(duì)照組PBS和無(wú)關(guān)肽組HBC在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率分別為 2.62%±1.58%、2.24%±2.02%。

圖4 CFSE法特異性CTL的體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 4 Specific lysis of target cells by the CTLs generated from the PBMCs of healthy donor

2.6 細(xì)胞因子染色法檢測(cè)長(zhǎng)肽體外免疫刺激后IFN-γ分泌水平

從HLA-A2+健康供者得到的PBMCs，DC荷載長(zhǎng)肽刺激PBMCs 3輪后，且體外培養(yǎng)18 d后，獲得特異性的CTL，細(xì)胞因子染色法檢測(cè)長(zhǎng)肽體外免疫刺激后IFN-γ分泌水平。結(jié)果顯示(圖5)，P778-800、P857-880長(zhǎng)肽疫苗能分泌較多的IFN-γ。

3 討論

惡性腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)。在現(xiàn)代城市中，惡性腫瘤死亡率和發(fā)病率已超過(guò)心腦血管疾病高居首位[14]。隨著發(fā)展的生物分子機(jī)制方面的深入探索，生物治療已然成為治療惡性腫瘤的發(fā)展模式，腫瘤疫苗作為腫瘤生物治療的重要組成部分，為腫瘤的治療和預(yù)防開(kāi)辟了新途徑。近年來(lái)腫瘤疫苗逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，并且得到了十分迅速的發(fā)展[15]。腫瘤多肽疫苗可以很好的被樹(shù)突狀細(xì)胞處理并提呈給T淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)肽特異性的CTL反應(yīng)[16]。在蛋白疫苗的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)腫瘤抗原編碼基因的序列分析，分析其被CD8+T淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原表位，構(gòu)建多肽疫苗，能夠加強(qiáng)人類淋巴細(xì)胞抗原和T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)的結(jié)合，而且還可以通過(guò)氨基酸替換、改變肽的構(gòu)象以及修飾氨基酸殘基等方法提高肽的免疫原性[17]。

圖5 細(xì)胞因子染色法檢測(cè)長(zhǎng)肽特異性CTL分泌IFN-γ的能力Fig 5 IFN-γ release ability assayed by intracellular cytokine staining assay >*P<0.05 vs PBS group

很多方法用于設(shè)計(jì)多表位長(zhǎng)肽。經(jīng)典的方法將最小表位連接在一起，在表位間使用間隔區(qū)或連接子才能達(dá)到最佳處理效果，而其他研究則沒(méi)有[18]。用于多表位長(zhǎng)肽設(shè)計(jì)的另一種方法包括應(yīng)用超過(guò)17個(gè)氨基酸的“天然”肽，長(zhǎng)肽需要蛋白酶體加工并將表位呈遞給CTL。長(zhǎng)肽不僅包含CD4+和Th細(xì)胞表位而且包含CTL表位，它們不直接與非APC上表達(dá)的 HLA-Ⅰ類分子結(jié)合，且氨基酸序列較長(zhǎng)，需要專業(yè)APCs如樹(shù)突狀細(xì)胞吞噬和處理長(zhǎng)肽，然后分別在 HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子的背景下呈遞CTL和Th細(xì)胞表位[19]。與短肽相比，長(zhǎng)肽更能克服免疫耐受的問(wèn)題。

本研究結(jié)果顯示P778-800、P857-880有很好的分泌IFN-γ的能力及殺傷靶細(xì)胞的能力，表明 HLA-Ⅰ分子不僅限于短肽(8～10個(gè)殘基)，而且部分長(zhǎng)肽可能具有更高的免疫原性[20]，因此需要進(jìn)一步研究了解它們?cè)诿庖邞?yīng)答中的作用程度。長(zhǎng)肽的結(jié)構(gòu)特征揭示了 HLA-Ⅰ裂隙的閉合構(gòu)象不是長(zhǎng)表位結(jié)合的障礙，可能通過(guò)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如β-發(fā)夾或α-螺旋)來(lái)穩(wěn)定凸起的表位；盡管即使沒(méi)有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，凸起的表位也不一定是靈活的[21]。因此，與傳統(tǒng) pMHC-Ⅰ表面相比，長(zhǎng)肽有戲劇性的表現(xiàn)，人們之前可能認(rèn)為這會(huì)導(dǎo)致TCR識(shí)別下降。相反，這些凸起的表位仍然具有免疫原性，盡管這些表位通常選擇限制性TCR庫(kù)，但具有長(zhǎng)肽的 TCR-pMHC-Ⅰ復(fù)合物已經(jīng)揭示出可能具有不同的TCR對(duì)接模式。進(jìn)一步的研究將有必要確定一個(gè)短肽TCR對(duì)接策略是否優(yōu)于其他長(zhǎng)肽的TCR對(duì)接策略。