張 強， 李 彬， 李曉光， 游國超， 高 毅

兔VX2腫瘤模型制作方法多種多樣，種植方式有開腹法及CT或超聲導引下經(jīng)皮穿刺種植法，瘤源包括細胞懸液或組織塊。開腹種植法創(chuàng)傷較大，細胞懸液種植法靶器官外種植轉移發(fā)生率較高，CT或超聲導引下組織塊種植法是目前常用的兔VX2腫瘤模型制作方法［1-2］。文獻報道中多采用空芯穿刺針穿刺兔肝臟/腎臟，再經(jīng)針尾將VX2組織塊用針芯推入，存在植入組織塊碎裂、大小不一、拔針時組織塊移位、成瘤大小和位置均質性差等問題。為此，本研究對傳統(tǒng)組織瘤塊種植法進行改良，體外將浸潤少量對比劑的明膠海綿條、腫瘤組織塊逆向預裝入穿刺針內(nèi)，然后在CT導引下經(jīng)皮穿刺靶器官，穿刺針到位后將組織塊和明膠海綿條“一步”推送植入，較傳統(tǒng)方法便捷省時、孤立成瘤率高。具體實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新西蘭大白兔26只，雌雄不限，體重2～3 kg，由北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物中心提供；VX2瘤株由中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院基礎研究所細胞中心提供。設備及器材包括前瞻性掃描2013型CT機（德國 Siemens公司）、Infinix-i INFX-8000 V 型DSA機（日本Toshiba公司）、16 G 8.5 cm種植穿刺針、一次性胸穿刺包（佛山特種醫(yī)用導管公司）、18 G穿刺套管針針芯（頭端磨平，作為種植穿刺針針芯）（美國Angiotech公司）、明膠海綿（廣州市快康醫(yī)療器械公司）、2%利多卡因（5 mL：1 g，中國大冢制藥公司）、3%戊巴比妥（美國Sigma公司）、肝素鈉（2 mL：12 500 U，江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司）、碘海醇注射液（350 mg I/mL，通用電氣藥業(yè)上海公司）。

1.2 種兔制作和組織塊體外預裝

將已凍存VX2瘤株組織迅速置于37℃水浴內(nèi)融化、快速復蘇，低溫以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量磷酸緩沖液（PBS）搖勻，制成細胞懸液備用。取VX2細胞懸液1 mL接種于腫瘤傳代兔后腿外側最厚肌肉群內(nèi)，2周后觀察接種部位是否可觸及腫塊，并作增強CT掃描，進一步確認荷瘤兔制備是否成功。

3%戊巴比妥（1 mL/kg）經(jīng)耳緣靜脈麻醉荷瘤兔，腫塊處備皮消毒，無菌條件下取出腫塊，切開、去除中心壞死組織，取邊緣生長旺盛的魚肉樣組織，用手術刀片切割成約l.0 mm×1.0 mm×3.0 mm組織塊，置于無菌0.9%NaCl溶液中備用。將明膠海綿塊修剪為1.5 mm×1.5 mm×3.0 mm長條狀數(shù)條備用；取無菌16 G 8.5 cm胸穿刺針，剪除尾端連接管；將18 G穿刺針針芯頭端磨平，消毒備用，于距離針芯頭端 9.5 cm處作一標記。將明膠海綿條沿長軸捻動壓縮，經(jīng)穿刺針頭端逆向填入針腔內(nèi)約3 cm，用1 mL注射器抽取對比劑0.3 mL，注入穿刺針針腔內(nèi)將明膠海綿條浸潤；用注射器針頭挑取腫瘤組織塊1條，經(jīng)穿刺針頭端逆向填入針腔內(nèi)，將組織塊完全填入（組織塊頭端距離針尖斜面0.5～1 cm）；用無菌0.9%NaCl溶液紗布將穿刺針頭端擦拭5～10次，去除針尖表面可能殘留的腫瘤細胞，完成組織塊預裝，備用（圖 1）。

1.3 兔VX2肝/腎腫瘤模型制作

圖1 “體外預裝示蹤一步植入技術”

兔VX2肝腫瘤模型——實驗兔耳緣靜脈用3%戊巴比妥（1 mL/kg）麻醉后，仰臥位固定于操作臺上，腹部備皮，消毒鋪巾；CT掃描定位穿刺點，設計進針路線，取肝左葉外側段為預接種部位；1%利多卡因2 mL作穿刺點局部麻醉，切開穿刺點皮膚約5 mm，用預裝穿刺針沿預先設計進針路線穿刺入1.5～2 cm，CT掃描確定針尖部位，使之位于肝左葉實質中部；位置合適后經(jīng)穿刺針尾端緩慢推送針芯至標記處并保留30 s，隨后緩慢旋轉并整體拔出穿刺針，穿刺點按壓1 min，再次消毒。術后即刻CT掃描確定高密度明膠海綿位置，預判種植部位。兔VX2腎腫瘤模型——實驗兔麻醉后，俯臥位固定于操作臺上，背部備皮，消毒鋪巾，CT掃描定位穿刺點，設計進針路線，取腎下極為種植部位；1%利多卡因2 mL作穿刺點及穿刺針道局部麻醉，切開穿刺點皮膚約5 mm，用預裝穿刺針沿預先設計進針路線穿刺入2～2.5 cm，CT掃描確定針尖部位，使之位于腎下極內(nèi)；位置合適后經(jīng)穿刺針尾端緩慢推送針芯至標記處并保留30 s，隨后緩慢旋轉并整體拔出穿刺針，穿刺點按壓1 min，再次消毒。術后即刻CT掃描確定高密度明膠海綿位置，預判種植部位。

術畢記錄植瘤時間（局部麻醉開始至拔針完成所用時間）。實驗兔自然清醒，送動物房飼養(yǎng)。2周后作增強CT掃描檢查，明確有無腫瘤生長，并與預判種植部位對比，明確腫瘤生長部位與預接種部位是否一致。3周后再次CT增強掃描檢查，明確腫瘤生長特點。取兩模型實驗兔各1只作肝、腎腫瘤組織學檢查，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色。后續(xù)經(jīng)兔隱動脈入路分別行肝、腎腫瘤栓塞［3］，觀察肝、腎VX2腫瘤造影表現(xiàn)。

1.4 隨訪觀察

接種后2周對種兔模型作CT平掃和增強掃描（管電壓 80 kVp，管電流 120 mAs，層厚 2 mm，矩陣512×512，照射野150 mm）——肝臟3期掃描，動脈期延遲6 s，門靜脈期31 s，延遲期37 s；腎臟2期掃描，動脈期延遲8 s，延遲期31 s——對比劑經(jīng)22 G靜脈留置針經(jīng)耳緣靜脈注入（劑量1 mL/kg，速率1.5 mL/s，壓力100 psi）。將CT成像傳送至Syngo工作站，分別檢測腫瘤矢狀面、橫斷面及冠狀面最大徑，采用“Oncology”及“Volume”軟件測定不同層面徑線，記錄腫瘤體積。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件作統(tǒng)計學處理，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。

2 結果

2只實驗種兔制作均成功，2周后種植部位可觸及腫塊，質硬。CT見種植部位肌肉內(nèi)類圓形強化腫塊，直徑約1.5 cm，周邊強化明顯。肝腫瘤接種10只兔，接種均獲成功，無感染及死亡發(fā)生；植瘤時間3.5～5.5 min，平均4.3 min。腎腫瘤接種10只兔，接種成功9只（9/10），無感染及死亡發(fā)生。植瘤時間4.3～6.5 min，平均 4.9 min。

肝腫瘤生長區(qū)與對比劑標記的高密度明膠海綿區(qū)基本一致。2周CT平掃表現(xiàn)為肝內(nèi)單發(fā)類圓形低密度病灶，動脈期周邊環(huán)狀強化，門靜脈期腫瘤周邊強化環(huán)密度逐漸減低，呈向心性強化趨勢，但不能完全使病灶強化，平衡期瘤周強化環(huán)密度進一步減低，中心可見未強化低密度區(qū)；3周病變明顯增大，強化特點與2周時相同，但中心未強化區(qū)明顯增大（圖2①～③）；4周出現(xiàn)肝肺轉移播散。隨訪期間無穿刺針道及肝外種植轉移發(fā)生，DSA檢查表現(xiàn)為肝內(nèi)單發(fā)病變，類圓形，病變周邊染色明顯（圖2④）。組織學檢查顯示腫瘤細胞核大深染，侵犯鄰近正常肝組織（圖2⑤）。VX2肝腫瘤徑線及體積變化見表1。

腎腫瘤生長區(qū)與對比劑標記的高密度明膠海綿區(qū)基本一致。2周時CT平掃腫瘤輪廓顯示不清，動脈期表現(xiàn)為腎下極單發(fā)占位性病變，強化不明顯，表現(xiàn)為腎皮質連續(xù)性中斷或皮質缺損；延遲掃描腫瘤邊界清楚、密度較腎實質低、類圓形，周邊輕度強化，中心強化不明顯，占位效應明顯，鄰近腎盞受壓變形，重建圖像顯示病變位于腎實質內(nèi)，未突破腎包膜；3周病變明顯增大，占位效應明顯，中心未強化區(qū)擴大，腫瘤突破腎皮質外生（圖3①～③）；4～5周腫瘤突破腎包膜，侵犯鄰近筋膜并出現(xiàn)肺轉移。DSA檢查表現(xiàn)為腎下極實質內(nèi)染色缺損區(qū)，占位效應明顯（圖3④）；組織學檢查顯示2周時腫瘤細胞核大深染，瘤組織未突破腎包膜（圖3⑤）。VX2腎腫瘤徑線及體積變化見表2。

圖2 VX2肝腫瘤種植影像及組織學隨訪結果

表1 VX2肝腫瘤徑線及體積隨時間變化 ±s

表1 VX2肝腫瘤徑線及體積隨時間變化 ±s

?

表2 VX2腎腫瘤徑線及體積隨時間變化 ±s

表2 VX2腎腫瘤徑線及體積隨時間變化 ±s

?

3 討論

圖3 VX2腎腫瘤種植影像及組織學隨訪結果

VX2腫瘤模型種植方法多種多樣［4-13］。既往多采用細胞懸液法制備，但操作過程繁瑣，最主要是易發(fā)生轉移和針道種植，使造模失敗，故不適合介入放射學動物實驗研究。目前多采用組織塊種植法，其簡便，易于成瘤，孤立成瘤率較高。開腹種植法創(chuàng)傷較大，而腹腔鏡種植法需要專門器械及操作技能。因此，影像設備導引下經(jīng)皮穿刺組織塊種植法是目前常用造模方法［7-8，10，12］。

既往報道影像導引下經(jīng)皮穿刺組織塊種植法多采用“后裝技術”，即穿刺針到位后再將組織塊及明膠海綿塊經(jīng)穿刺針尾部緩慢推入。但該方法有以下缺點：組織塊在針腔內(nèi)移行距離長，與針腔內(nèi)壁摩擦，可能損傷部分組織；“后裝技術”耗時且不便捷，裝填組織塊時需要固定穿刺針，穿刺針隨實驗兔呼吸可能在體內(nèi)移位，從而使種植部位發(fā)生移位，特別是對體積相對小的臟器如腎臟，更易發(fā)生穿刺針移位，導致植瘤失敗。為此，本實驗改進該方法，采用“體外預裝示蹤一步植入技術”——先體外逆向將明膠海綿條填入穿刺針內(nèi)，并用對比劑浸潤明膠海綿，起示蹤作用，后再逆行填入修剪好的組織塊1條于針腔內(nèi)，預裝完成后反復擦拭穿刺針尖部，去除表面可能殘留的組織塊碎屑或細胞。采用預裝好的穿刺針直接穿刺，穿刺針到位后可快速將組織塊推送入靶器官，耗時明顯減少，且組織塊在針腔內(nèi)移行距離明顯縮短，降低了組織塊損傷及組織碎屑脫落概率，進而降低移位種植風險。

與VX2肝腫瘤模型近似，超聲及CT導引下組織塊種植法也是較為理想的VX2腎腫瘤模型制作方法［13-16］，成瘤率為 40%～100%［17-18］。由于腎臟較肝臟小，影像導引下種植較肝臟困難，準確判定針尖位置至關重要；CT較超聲有較高的組織分辨率和空間分辨率，采用CT導引下組織塊種植，即刻CT掃描即可顯示腫瘤種植部位是否理想。本實驗腎腫瘤種植成瘤率90%（9/10），均為單發(fā)成瘤，無腎外種植發(fā)生，2周腫瘤主要位于腎實質內(nèi)。因此，該方法是理想的兔VX2腫瘤模型制作方法。

本實驗采用 “體外預裝示蹤一步植入技術”制作兔VX2肝/腎腫瘤模型，優(yōu)點在于腫瘤組織塊已預裝好，穿刺針位置理想后即可用針芯推送，可減少穿刺針在體內(nèi)滯留時間及移位概率，縮短手術時間，術后可即刻了解腫瘤種植部位，便捷有效；結果顯示腫瘤生長區(qū)與對比劑標記的高密度明膠海綿區(qū)基本一致。浸潤對比劑的明膠海綿條既起到示蹤作用，又可封堵穿刺針道，防止出血和組織塊在拔針時移位于靶器官外，發(fā)生種植轉移。本實驗采用大小長度基本一致的單一組織塊種植，與既往報道相比增加了組織塊長度，未增加組織塊數(shù)量，結果均可成瘤，且為孤立種植瘤，2～3周隨訪無靶器官外種植轉移。種植瘤大小和位置均一性好，更加適合進行肝/腎腫瘤經(jīng)導管動脈栓塞或經(jīng)皮消融實驗研究。

［1］ 錢 亭，陳茂振，高 峰，等．兩種方法建立兔VX2肝癌模型的比較及影像學評估［J］．介入放射學雜志，2014，23：58-61．

［2］ 李遠競，劉 穎，沈維紅，等．超聲引導下組織塊接種制作兔VX2瘤模型［J］．中國醫(yī)學影像技術，2008，24：1886-1888．

［3］ 張 強，郭子義，李 彬，等．隱動脈置管在兔肝腎動脈介入治療中的應用［J］．介入放射學雜志， 2015， 24： 1090-1094．

［4］ 楊 林，李祖茂，周翔平．兔VX2肝癌動物模型的建立［J］．川北醫(yī)學院學報，2010，25：156-159．

［5］ 朱光宇，滕皋軍，牛煥章，等．兔VX2肝癌模型建立方法的比較及股動脈插管方法的應用［J］．中國醫(yī)學影像技術，2006， 22： 1785-1788．

［6］ 魯 東，呂維富，高 斌，等．兔VX2肝癌模型的改良制作及肝血管造影技術探討［J］．醫(yī)學影像學雜志，2009，19：1333-1337．

［7］ 王 凱，蔣國民，趙進委，等．CT引導下兔VX2肝癌模型制作及血管造影技術［J］．中國介入影像與治療學，2010，7：664-667．

［8］ 邵海波，徐 克，蘇洪英，等．CT引導下套管針種植法制作兔雙灶肝癌模型的評價［J］．介入放射學雜志，2011，20：292-295．

［9］ Chen Z，Kang Z，Xiao EH，et al.Comparison of two different laparotomy methods for modeling rabbit VX2 hepatocarcinoma［J］.World J Gastroenterol， 2015， 21： 4875-4882.

［10］ Sun JH， Zhang YL， Nie CH， et al.Considerations for two inoculation methods of rabbit hepatic tumors：pathology and image features［J］.Exp Ther Med， 2012， 3： 386-390.

［11］ Parvinian A， Casadaban LC， Gaba RC.Development， growth，propagation，and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer： a pictorial primer and “how to” guide［J］.Diagn Interv Radiol， 2014， 20： 335-340.

［12］ White SB， Chen J， Gordon AC， et al.Percutaneous ultrasound guided implantation of VX2 for creation of a rabbit hepatic tumor model［J］.PLoS One， 2015， 10： e0123888.

［13］涂 剛，喬天愚，楊光永．VX2兔腎癌模型的制作及傳代保存［J］．中華泌尿外科雜志， 1999， 20： 167．

［14］Lee JM，Kim SW，Chung GH，et al.Open radio-frequency thermal ablation of renal VX2 tumors in a rabbit model using a cooled-tip electrode： feasibility， safety， and effectiveness［J］.Eur Radiol， 2003， 13： 1324-1332.

［15］ Ho Y， Huang Y， Lin C， et al.Application of radiofrequency ablation of renal VX2 tumors by cooled-tip electrode in a rabbit model［J］.J Endourol， 2009， 23： 677-684.

［16］王玉忠，郭宏騫，劉光香．兔VX2腎癌模型的構建及其外周血細胞因子的變化［J］．江蘇大學學報·醫(yī)學版，2011，21：23-25．

［17］王子明，佘軍軍，程 偉，等．兔腎VX2移植瘤模型的建立及其超聲顯像檢測［J］．西安交通大學學報·醫(yī)學版，2006，27：55-58．

［18］Bruners P，Braunschweig T，Hodenius M，et al.Thermoablation of malignant kidney tumors using magnetic nanoparticles：an in vivo feasibility study in a rabbit model［J］.Cardiovasc Intervent Radiol， 2010， 33： 127-134.