沈雋霏, 吳文浩, 周佳燁, 王蓓麗, 郭 瑋, 潘柏申
(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200032)
全國(guó)腫瘤登記中心最新的數(shù)據(jù)顯示,2012年全國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率居第1位的是肺癌,每年新發(fā)病例約70.5萬。全國(guó)惡性腫瘤死亡率居第1位的也是肺癌,每年死亡病例約56.9萬[1],其中小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)約占新發(fā)肺癌病例的20%,雖然發(fā)病率遠(yuǎn)不及非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC),但是SCLC惡性程度更高,侵襲性更強(qiáng),易早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后極差[2]。因此,早期診斷SCLC是提高治療效果和改善預(yù)后的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)早期SCLC微小的散在病灶,而組織活檢局限性更大,因此血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)有著更大的優(yōu)勢(shì),如無創(chuàng)、操作方便、成本低廉等。一直以來,輔助診斷SCLC的主要腫瘤標(biāo)志物為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE),但NSE的特異性不佳且易受溶血干擾,因此近年來胃泌素釋放肽前體(pro-gastrin-releasing peptide,ProGRP)作為一種輔助診斷SCLC的新腫瘤標(biāo)志物受到了廣泛關(guān)注[3-5]。我們對(duì)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ProGRP的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)并初步評(píng)估其臨床應(yīng)用價(jià)值。
選取2014年1—12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院確診的SCLC患者48例,其中男45例、女3例,年齡38~77歲,所有患者均通過病理活檢或細(xì)胞學(xué)檢查[4-5]明確診斷;NSCLC患者79例,其中男47例、女32例,年齡33~81歲;肺部良性疾病患者40例,其中男17例、女23例,年齡24~84歲,包括社區(qū)獲得性肺炎、肺部血管瘤、間質(zhì)性肺炎、肺部錯(cuò)構(gòu)瘤等;其他腫瘤患者60例,其中男34例、女26例,年齡40~84歲,包括食管癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等常見惡性腫瘤;自身免疫性疾病患者20例,其中男6例、女14例,年齡21~82歲,包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性血管炎等。以上所有對(duì)象均排除合并腎臟疾病。另選取復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院同期體格檢查和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查均無異常的表觀健康者120名作為正常對(duì)照組,其中男60名、女60名,年齡22~74歲。
1.2.1 樣本采集 采用BD促凝分離膠真空采血管(美國(guó)BD公司)采集所有對(duì)象的空腹靜脈血樣本。樣本采集后2 h內(nèi)196×g離心10 min,分離血清后置-80 ℃保存,樣本復(fù)融后需在2 h內(nèi)完成檢測(cè)。
1.2.2 檢測(cè)方法 分別采用電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)ProGRP,試劑盒分別由瑞士Roche公司、美國(guó)Abbott公司和CanAg診斷產(chǎn)品(北京)有限公司提供。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、NSE和細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19-fragment,CYFRA21-1)試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)均由瑞士Roche公司提供。檢測(cè)儀器分別為 cobas e601全自動(dòng)免疫分析儀(瑞士羅氏公司)、ARCHITECT i2000sr全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀(美國(guó)雅培公司)和ST-360酶標(biāo)儀(上??迫A公司)。
1.2.3 精密度評(píng)價(jià) 以高、低2個(gè)水平的混合血清作為待測(cè)樣本,分別連續(xù)檢測(cè)20次,計(jì)算均值及變異系數(shù)(coefficient of variation,CV),以此作為批內(nèi)精密度。將高、低2個(gè)水平的混合血清分裝后于-20 ℃保存,連續(xù)檢測(cè)20 d,計(jì)算均值及CV,以此作為批間精密度。
1.2.4 回收試驗(yàn) 重復(fù)測(cè)定混合血清10次,取均值,以此作為基礎(chǔ)水平,在該基礎(chǔ)血清中分別按1∶1的比例加入高值(261.0 pg/mL)和低值(15.8 pg/mL)定值標(biāo)準(zhǔn)品作為回收樣本,每份回收樣本重復(fù)檢測(cè)3次,取均值并與理論值進(jìn)行比較,計(jì)算回收率。
1.2.5 線性范圍驗(yàn)證 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(the Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)EP6-A2文件[6],將系列稀釋后的5個(gè)水平的樣本按低值到高值和高值到低值分別檢測(cè)2次,計(jì)算均值后分別使用一次方程、二次方程和三次方程進(jìn)行擬合,以評(píng)估是否呈線性。
1.2.6 參考區(qū)間驗(yàn)證 參考CLSI EP28-A3c文件[7],采用20名表觀健康者樣本驗(yàn)證試劑盒給定參考區(qū)間的適用性。若20名表觀健康者的ProGRP檢測(cè)結(jié)果高于給定參考區(qū)間的人數(shù)≤2名,認(rèn)定該參考區(qū)間適用;若>2名則需要重新驗(yàn)證或自行建立參考區(qū)間。
1.2.7 方法學(xué)比較 采用電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA同時(shí)檢測(cè)40份血清樣本,剔除超過檢測(cè)上限需要稀釋的結(jié)果,通過Pearson相關(guān)分析和Bland-Altman偏差分析比較不同方法檢測(cè)結(jié)果的一致性,以x ±1.96s作為一致性界限。
1.2.8 臨床應(yīng)用評(píng)價(jià) 比較SCLC組、NSCLC組、各疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組ProGRP結(jié)果的差異。以臨床病理結(jié)果或細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),評(píng)估ProGRP單項(xiàng)或聯(lián)合其他腫瘤標(biāo)志物(CEA、NSE、CYFRA21-1)診斷SCLC的性能,比較不同檢測(cè)方法的診斷效能。
采用SPSS 19.0和Medcalc 12.7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均呈非正態(tài)分布,以中位數(shù)(M)[四分位數(shù)(P25~P75)]表示,組間差異比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評(píng)估ProGRP單項(xiàng)或聯(lián)合其他腫瘤標(biāo)志物診斷SCLC的性能及不同檢測(cè)方法的診斷效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1.1 精密度 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)高、低2個(gè)水平ProGRP的批內(nèi)精密度分別為0.8%和1.2%,批間精密度分別為0.9%和2.2%。見表1。
2.1.2 回收試驗(yàn) 基礎(chǔ)血清ProGRP水平為226.2 pg/mL,分別與ProGRP高值、低值定值標(biāo)準(zhǔn)品1∶1混合后重新測(cè)定,回收率分別為99.86%和98.32%。見表2。
表1 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ProGRP的精密度結(jié)果
表2 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ProGRP的回收試驗(yàn)結(jié)果
2.1.3 線性范圍驗(yàn)證 一次多項(xiàng)式擬合方程為Y=0.995X+16.35,r2=1.0;二次多項(xiàng)式系數(shù)a的P值為0.731;三次多項(xiàng)式系數(shù)a的P值為0.669,b的P值為0.579。結(jié)果顯示二次、三次多項(xiàng)式系數(shù)與“0”差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證明電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ProGRP在33.13~4 796.00 pg/mL范圍內(nèi)線性良好。
2.1.4 參考區(qū)間驗(yàn)證 20名表觀健康者ProGRP檢測(cè)結(jié)果均在試劑盒聲明的參考區(qū)間內(nèi)(0~69 .2 pg/mL),參考區(qū)間驗(yàn)證通過。
2.1.5 方法學(xué)比較 Pearson相關(guān)分析顯示電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測(cè)ProGRP的結(jié)果相關(guān)性良好(電化學(xué)發(fā)光法與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法 r=0.988,P<0.001;電化學(xué)發(fā)光法與ELISA r=1.000,P<0.001;化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法與ELISA r=0.989,P<0.001)。Bland-Altman偏差分析顯示電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA ProGRP結(jié)果在低值區(qū)域一致性良好,但隨著檢測(cè)結(jié)果的增加,偏差逐漸增大,當(dāng)ProGRP>500 pg/mL時(shí)出現(xiàn)趨勢(shì)性偏差,見圖1。
圖1 電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測(cè)ProGRP的Bland-Altman偏差分析
2.2.1 各組間ProGRP水平的比較 SCLC組、NSCLC組、肺部良性疾病組、其他腫瘤組、自身免疫性疾病組和正常對(duì)照組ProGRP水平分別為785.8(72.2~2 842.8)、43.1(31.2~50.0)、46.5(32.3~54.9)、32.5(17.1~48.6)、27.8(20.7~33.5)和30.8(17.3~42.5)pg/mL。SCLC組ProGRP水平明顯高于其他各組(P<0.05),而其他各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.2.2 ProGRP診斷SCLC的性能 ProGRP診斷SCLC的ROC曲線的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.963[95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)0.868~0.931],最佳臨界值為66.65 pg/mL,敏感性為79.2%,特異性為95.3%,陽性預(yù)期值為71.68%(95%CI 57.64~ 83.20),陰性預(yù)期值為96.83%(95%CI 94.24~98.47)。見圖2。
圖2 ProGRP診斷SCLC的ROC曲線
2.2.3 ProGRP聯(lián)合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的性能 為進(jìn)一步研究ProGRP聯(lián)合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的性能,以診斷結(jié)果為因變量,ProGRP、NSE、CEA、CYFRA21-1為自變量,使用二元Logistic回歸分析分別擬合ProGRP聯(lián)合NSE(ProGRP+NSE)的方程、4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合(ProGRP + NSE+ CEA+ CYFRA21-1)的方程來預(yù)測(cè)二分位結(jié)果,并將2次擬合后的預(yù)測(cè)值與ProGRP和NSE一同繪制ROC曲線。結(jié)果顯示,ProGRP+NSE診斷SCLC的AUC為0.957、敏感性為83.3%、特異性為96.2%、陽性預(yù)期值為81.6%、陰性預(yù)期值為96.6%,診斷性能明顯優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè)(P<0.05);與4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的診斷性能比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖3。
2.2.4 電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測(cè)ProGRP診斷SCLC的ROC曲線比較 ROC曲線分析顯示,電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測(cè)ProGRP診斷SCLC的AUC(95%CI)分別為0.880(0.830~0.919)、0.892(0.844~0.929)、0.908(0.863~0.943),各方法間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。
表3 ProGRP聯(lián)合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的性能評(píng)估
圖3 ProGRP聯(lián)合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的ROC曲線
胃泌素釋放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)是一種重要的調(diào)節(jié)分子,與人體許多生理功能、病理狀態(tài)有關(guān)。GRP是一種胃腸激素,最初由MCDONALD等[8]從豬胃黏膜中分離,廣泛分布于哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道和呼吸道[9]。有研究顯示GRP在SCLC患者中呈高表達(dá),且對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有較大的意義[10-11]。然而,由于GRP的半衰期極短(約2 min),因此難以準(zhǔn)確完成臨床檢測(cè)。相比之下,GRP的前體結(jié)構(gòu)——ProGRP更為穩(wěn)定,其3種不同分子亞型的共同C端序列ProGRP(31~98)可作為輔助診斷SCLC的可靠腫瘤標(biāo)志物[12]。
圖4 電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測(cè)ProGRP診斷SCLC的ROC曲線
本研究結(jié)果顯示電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ProGRP的精密度、正確度、線性范圍、參考區(qū)間等各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合檢測(cè)要求。Pearson相關(guān)分析顯示電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測(cè)ProGRP的相關(guān)性良好,Bland-Altman偏差分析顯示電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測(cè)結(jié)果的偏差總體在合理范圍內(nèi),3種方法在低值部分具有良好可比性,但偏差隨檢測(cè)結(jié)果的增加而增大,ProGRP>500 pg/mL時(shí)可比性較差。
本研究結(jié)果顯示,SCLC組ProGRP水平明顯高于其他各組(P<0.05),與文獻(xiàn)報(bào)道[13]基本一致;而NSCLC組、肺部良性疾病組、其他腫瘤組和正常對(duì)照組ProGRP水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ProGRP診斷SCLC的敏感性為79.2%、特異性為95.3%、陽性預(yù)期值為71.68%、陰性預(yù)期值為96.83%,稍優(yōu)于NSE。NSE在檢測(cè)時(shí)易受溶血干擾,而ProGRP幾乎不受溶血影響,但患者腎功能不全會(huì)導(dǎo)致ProGRP水平升高,從而影響結(jié)果判斷[14],因此ProGRP與NSE在輔助診斷SCLC時(shí)能互補(bǔ)。ProGRP與NSE聯(lián)合檢測(cè)診斷SCLC的敏感性為83.3%、特異性為96.2%、陽性預(yù)期值為81.6%、陰性預(yù)期值為96.6%,診斷性能明顯優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè),且與4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的診斷性能無差異。
電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測(cè)ProGRP診斷SCLC時(shí)的AUC分別為0.880、0.892和0.908,三者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明3種方法的診斷效能基本相同,但電化學(xué)發(fā)光法和化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法的檢測(cè)范圍相比ELISA更寬,檢測(cè)時(shí)間更短,具有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
綜上所述,ProGRP是輔助診斷SCLC的可靠指標(biāo),具有很好的敏感性及特異性,有助于肺癌的組織學(xué)分型,還能與NSE聯(lián)合檢測(cè),有利于早期診斷SCLC,改善患者的預(yù)后,具有良好的臨床應(yīng)用前景。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道ProGRP對(duì)SCLC的療效監(jiān)測(cè)、復(fù)發(fā)評(píng)估以及預(yù)后評(píng)估均具有一定的價(jià)值[15],有關(guān)這幾方面的情況將在今后的研究中進(jìn)一步探討。
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