張 鵬， 羅 琴， 汪婷婷， 袁向亮， 沈立松

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗科，上海 200092）

胃癌是消化道常見的腫瘤之一[1]，2015年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《Global Cancer Statistics， 2012》報告指出，胃癌的發(fā)病例數(shù)高居惡性腫瘤的第4位。根據(jù)2015年CHEN等[2]的研究數(shù)據(jù)顯示，2015年我國胃癌新發(fā)病例679 100例，死亡病例498 000例。胃癌嚴(yán)重威脅我國人民的健康[3]。

胃癌病因十分復(fù)雜，但最終都在不同階段作用于不同基因，引起相關(guān)基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平的改變，這些基因共同作用最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生、發(fā)展。高通量測序技術(shù)及基因芯片技術(shù)的快速發(fā)展，使基因數(shù)據(jù)大量累積。美國國立生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）、美國癌癥和腫瘤基因圖譜計劃（the Cancer Genome Atlas，TCGA）是世界上最大的公共資源基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，包含了數(shù)以億計的資源，這種豐富的基因組數(shù)據(jù)具有很大的潛力，影響未來對疾病的研究模式，癌癥基因組學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步正在徹底改變各種癌癥的分子表征。2014年《Nature》發(fā)文總結(jié)了胃腺癌基于基因的亞類分型標(biāo)準(zhǔn)并把其作為TCGA項目的一部分，這些亞型的鑒定為患者分層和靶向治療提供了指導(dǎo)[4]。這些研究也導(dǎo)致了基于基因的新型胃癌分子分類系統(tǒng)的發(fā)展，表明了胃癌發(fā)病機(jī)制中驅(qū)動突變的重要性，并且發(fā)現(xiàn)了大量新的驅(qū)動基因突變[5]。如何有效地將這一基因組數(shù)據(jù)為臨床和科研提供更好的支持成了一個新的挑戰(zhàn)，本研究嘗試?yán)肎EO中有關(guān)胃癌的數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)的方法研究胃癌相關(guān)的基因，篩選并預(yù)測與胃癌發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)的基因特征和意義，為腫瘤研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究所有原始數(shù)據(jù)均從GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載。GEO的納入標(biāo)準(zhǔn)：具備胃癌組織和正常癌旁對照組織的全基因組測序數(shù)據(jù)，且數(shù)據(jù)集覆蓋胃癌不同的分期和不同的組織類型。排除對胃癌患者進(jìn)行藥物干預(yù)或其他干預(yù)的對比測試結(jié)果，以及測序數(shù)據(jù)集包含的樣本量過少和沒有正常對照的數(shù)據(jù)集。共采集腫瘤樣本1 076份，正常癌旁組織對照樣本196份。篩選數(shù)據(jù)庫樣本組成為GSE79973、GSE54129、GSE13911，驗證數(shù)據(jù)庫樣本組成為GSE14210、GSE15459、GSE22377、GSE29272、GSE51105、GSE62254。

1.2 方法

1.2.1 篩選差異基因 從NCBI的GEO下載胃癌相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)：GSE79973、GSE54129、GSE13911。使用GEO2R分析平臺（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/），利用R語言程序包limma對表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因提取，導(dǎo)出3個數(shù)據(jù)集中有差異的基因文件進(jìn)一步篩選“LogFC＞2.0和LogFC＜-2.0，且P＜0.05的基因”，篩選出的數(shù)據(jù)集分別命名為GSE79973D1、GSE13911D1、GSE54129D1，以備后續(xù)分析所用。

1.2.2 利用韋恩圖（VENNY）篩選目標(biāo)基因 把上述GEO2R分析輸出的數(shù)據(jù)集GSE79973D1、GSE13911D1、GSE54129D1，利用VENNY進(jìn)一步篩選。本研究選取3個數(shù)據(jù)兩兩相交及3個共同表達(dá)的基因為研究對象，定義為“至少在2個樣本庫中表達(dá)有差異的基因”，命名為VIG（very important gene），共有基因339個。

1.2.3 基因本體（gene ontology，GO）富集分析 GO是基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系。通過將差異基因做GO富集分析，可以把基因按不同的功能進(jìn)行歸類，達(dá)到對基因進(jìn)行注釋和分類的目的。采取的方法是fisher精確檢驗，數(shù)據(jù)包采用 clusterProfiler，來自 R/bioconductor。選擇標(biāo)準(zhǔn)是落在某個term/GO上差異的基因數(shù)目≥4，P＜0.05， 按照富集程度的值從大至小降序排列，取前 30 個結(jié)果作圖。Enrich_factor定義=（某個term中的差異基因數(shù)目/總的差異基因數(shù)目）/（數(shù)據(jù)庫term中總的基因數(shù)目/數(shù)據(jù)庫中總的基因數(shù)目）。

1.2.4 京都基因與基因組百科全書（the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 KEGG通路分析的信號通路是多個蛋白質(zhì)之間相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和代謝活動的過程。本研究分析差異基因主要利用公共數(shù)據(jù)庫KEGG來進(jìn)行分類，對Pathway中的基因進(jìn)行基于離散分布的顯著性分析，得到與實驗?zāi)康娘@著相關(guān)的Pathway分類。采取的方法是fisher精確檢驗，數(shù)據(jù)包采用clusterProfiler，來自 R/bioconductor。選擇的標(biāo)準(zhǔn)是落在某個 term/pathway 上差異的基因數(shù)目≥4，P＜0.05，按照富集程度的值以大小降序排列，取前 30 個結(jié)果作圖。

1.2.5 生存期分析 利用KM-Plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/）驗證差異基因的表達(dá)和分析關(guān)鍵基因?qū)ξ赴┗颊呱鏁r間的影響。使用數(shù)據(jù)庫中876例胃癌患者信息，根據(jù)中位數(shù)將目的基因分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，利用缺省設(shè)置，在線分析目標(biāo)基因?qū)ξ赴┗颊呖偵娴念A(yù)后價值。

2 結(jié)果

2.1 篩選在胃癌組織和癌旁對照組織中表達(dá)有差異的基因

本研究首先利用GEO2R分析平臺對選取的3個樣本集GSE54129、GSE79973、GSE13911的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和過濾，篩選出差異基因后進(jìn)一步篩選出差異的顯著性＜0.05、差異倍數(shù)＞2倍的基因。本研究把篩選出的基因合并后得到差異基因1 480個，其中上調(diào)基因879個，下調(diào)基因601個。取2個以上數(shù)據(jù)集中有交集的基因共339個（圖1），進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

圖1 對差異基因進(jìn)行篩選的VENNY模式圖

2.2 胃癌差異基因的生物過程分析

通過GO富集分析顯示這些胃癌表達(dá)差異基因主要分布在胃、十二指腸、結(jié)腸、肌腱、肺、腎等組織。差異基因參與了消化、藥物代謝、類黃酮代謝、視黃酸代謝、膠原蛋白分解代謝、酮化合物代謝等1 126個生物過程。其中與消化相關(guān)的基因有GKN1、SST、SSTR1等，參與膠原蛋白分解的基因有MMP3、ADAMTS2、COL10A1等，參與多柔比星藥物代謝的基因有AKR1B10、AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3。富集程度位于前幾位的基因主要參與的生物過程是消化、藥物代謝、酮類代謝、膠原蛋白代謝。見圖2。

圖2 GO生物過程基因富集結(jié)果

2.3 胃癌表達(dá)差異基因參與的信號通路分析

使用基于KEGG的通路分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因共涉及信號通路111條，主要的信號通路有：細(xì)胞色素P450代謝途徑、藥物代謝、視黃醇代謝、甾類激素生物合成、酪氨酸代謝、胃酸分泌、血管內(nèi)皮生長因子受體3信號傳導(dǎo)、谷胱甘肽酶、戊糖和葡萄糖醛酸互變等。信號通路的分析與GO功能的分析相吻合，主要集中在消化、藥物代謝和類固醇、視黃醇代謝等途徑。另外，在通路分析中差異基因在血管內(nèi)皮生長因子信號通路和細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用中富集也很顯著，其中差異基因中富集程度較高的基因主要集中在細(xì)胞色素P450家族、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶家族等。見表1。

表1 胃癌表達(dá)差異基因的信號通路分析

2.4 胃癌關(guān)鍵基因的表達(dá)水平及對胃癌患者生存時間的影響

為了驗證我們的發(fā)現(xiàn)，本研究使用KMPlotter數(shù)據(jù)庫對上述基因在胃癌中的表達(dá)水平進(jìn)行了驗證。KM-Plotter數(shù)據(jù)庫包括6個數(shù)據(jù)集，即GSE29272、GSE51105、GSE14210、GSE15459、GSE22377、GSE62254，共1 051個胃癌樣本全基因組測序數(shù)據(jù)和對應(yīng)的876例生存時間數(shù)據(jù)。上述差異基因在KM-Plotter數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)情況與本研究之前選擇的數(shù)據(jù)集表達(dá)一致。本研究對關(guān)鍵基因根據(jù)目標(biāo)基因表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行生存曲線分析。結(jié)果顯示細(xì)胞色素P450家族2亞科C成員18（cytochrome P450 family 2 subfamily C member 18，CYP2C18）高表達(dá)組總生存時間顯著高于低表達(dá)組（P=0.001 2）。同樣，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族成員GSTA3、膠原蛋白家族成員COL1A1、醛脫氫酶3家族成員ALDH3A1，高表達(dá)組總生存時間均顯著降低（圖3）。神經(jīng)元分化因子1（neuronal differentiation 1，NEUROD1）基因在胃癌患者中mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)，但高表達(dá)的胃癌患者生存時間卻相對較低（P=0.000 26）；前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）基因在胃癌患者中mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，但高表達(dá)的胃癌患者的生存時間卻顯著延長（P=0.001 3）。提示這些差異基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著不同的作用。因此，對篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗證，將會對研究其確切的功能具有重要的意義。

圖3 胃癌關(guān)鍵基因?qū)ξ赴┗颊呱鏁r間的影響

3 討論

本研究利用公共數(shù)據(jù)資源GEO，使用在線分析平臺GEO2R篩選出在胃癌和癌旁組織表達(dá)有差異的基因，并對這些差異基因進(jìn)行了生物過程分析和信號通路分析，發(fā)現(xiàn)主要集中于細(xì)胞色素P450家族、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶家族等基因簇。對這些關(guān)鍵基因的進(jìn)一步分析，新發(fā)現(xiàn)ALDH3A1、NEUROD1等基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而且這些關(guān)鍵基因與胃癌生存時間顯著相關(guān)。

在本研究中，我們鑒定發(fā)現(xiàn)的胃癌差異基因包括了細(xì)胞色素P450家族和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶家族等基因簇。已有的研究也證實這些基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。P450家族基因可參與抗腫瘤藥物的代謝。環(huán)磷酰胺及其異構(gòu)體異環(huán)磷酰胺通過肝臟P450酶催化而活化，提高了此類藥物的敏感性[6]。細(xì)胞色素P450家族2亞科E成員1 （cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1）基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生相關(guān)[7]，其參與胃癌發(fā)病的機(jī)制可能與其參與亞硝胺及前致癌物N-亞硝基二甲胺和N-亞硝基四吡咯烷的代謝，以及參與黃曲霉屬和四氯化碳的活性代謝相關(guān)[8]。已有研究表明，COL1A1在胃癌癌變前和惡性組織中的水平顯著高于正常組織，并且與腫瘤的進(jìn)展、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[9]，而癌變組織中COL1A2的表達(dá)水平高于癌前病變和正常組織，因此COL1A1 和COL1A2可以作為胃癌的監(jiān)測和預(yù)后因子。已有研究顯示GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性是胃癌的危險因素[10]，GSTM1基因和GSTT1 null基因型的患者癌前病變風(fēng)險增加，而GSTP1Val等位基因的存在則會減少癌變前損傷的風(fēng)險[11]。JO等[12]研究認(rèn)為UGT1A1基因的表達(dá)與晚期胃癌患者的治療相關(guān)。WANG等[13]的研究提示UGT1A1多態(tài)性可以用來篩選胃癌的風(fēng)險人群，TYMS、TUBB3和STMN1或可作為預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物用于晚期胃癌的化療指導(dǎo)。這些已有的差異基因研究報道進(jìn)一步證實本研究的分析篩選模型是有效的，在尋找胃癌相關(guān)的基因和蛋白上具有良好的效果。

通過深入檢索本研究篩選的這些差異基因，我們發(fā)現(xiàn)了一些處于網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點的關(guān)鍵差異基因如ALDH3A1、NEUROD1等，但尚未見其對胃癌的意義的相關(guān)報道。ALDH3A1是乙醛脫氫酶3家族成員，PATEL等[14]曾經(jīng)報道ALDH3A1在肺癌中升高，國內(nèi)袁青等[15]報道了乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2 family，ALDH2）基因多態(tài)性及生活習(xí)慣與胃癌易感性的相關(guān)性分析，認(rèn)為ALDH2基因多態(tài)性與胃癌易感性有關(guān)。ALDH3A1在胃癌中意義尚未見報道，本研究分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)此基因的胃癌患者生存期顯著縮短（P=0.032），推測與胃癌進(jìn)展相關(guān)。NEUROD1是轉(zhuǎn)錄因子NeuroD家族的成員，已有報道其多與乳腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、前列腺癌、糖尿病有關(guān)[16-17]，尚未發(fā)現(xiàn)在胃癌中的研究報道。本研究通過生存時間分析發(fā)現(xiàn)，NEUROD1高表達(dá)胃癌患者的生存時間顯著縮短，說明該基因的異常表達(dá)對胃癌患者是有意義的。進(jìn)一步蛋白交互作用分析證實該基因可能經(jīng)由胰島素與AKT1基因有交互作用，推測NEUROD1可能經(jīng)由胰島素參與了絲氨酸/蘇氨酸激酶介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子信號途徑或是通過GPCR信號傳導(dǎo)和MAP3K5的磷酸化參與了細(xì)胞的凋亡等過程。絲氨酸/蘇氨酸激酶1是PI3K/AKT信號通路的重要組成部分。該通路可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化，而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管的生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解相關(guān)[16]。在本研究鑒定發(fā)現(xiàn)的差異基因中還有一些基因如PTGS2等在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮不同的作用。與PTGS2相關(guān)的疾病包括結(jié)腸直腸腺瘤和消化性潰瘍。在癌細(xì)胞中，PTGS2是前列腺素E2生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟的產(chǎn)物。有研究顯示，PTGS2等位基因攜帶者罹患胃癌的風(fēng)險增加[17]。本研究結(jié)果也顯示，胃癌患者PTGS2 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，這提示該基因與胃癌的發(fā)生相關(guān)。但生存時間分析發(fā)現(xiàn)PTGS2高水平表達(dá)的胃癌患者，其生存時間顯著延長，這提示該基因在胃癌的進(jìn)展中可能發(fā)揮保護(hù)性因子的作用。因此，對PTGS2等基因在胃癌中的表達(dá)特征和意義需進(jìn)一步研究，以明確其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的功能特征和作用。

本研究建立的篩選分析模型為研究腫瘤提供了一個新的思路：通過公共數(shù)據(jù)庫GEO和TCGA相關(guān)腫瘤的全基因組測序數(shù)據(jù)，對在癌組織和對照組織中表達(dá)有差異的基因進(jìn)行全面分析，找出與腫瘤相關(guān)的核心基因，對這些關(guān)鍵基因參與的生物過程和信號通路進(jìn)行分析，對在主要生物過程和通路中參與的基因進(jìn)行蛋白交互作用分析，然后對處于網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點的基因進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘，尋找研究的突破點，繼而用基因突變分析工具和生存時間分析工具來驗證該基因?qū)δ[瘤患者總生存時間的影響，綜合分析某基因在腫瘤中的表達(dá)特征和意義，可為進(jìn)一步開展相關(guān)的功能研究提供理論支持和指導(dǎo)。

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