李玲利,蘇振國(guó),張永紅,邵榆嵐,白興榮

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所,云南蒙自 661101)

家蠶微粒子Nosemabombycis是家蠶馴養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的一種專化寄生于家蠶細(xì)胞內(nèi)的病原,長(zhǎng)期與家蠶協(xié)同進(jìn)化后其增殖、能量代謝高度依賴宿主家蠶,微粒子侵入家蠶體內(nèi)后可呈J型指數(shù)增殖方式快速引起家蠶微粒子病爆發(fā),擴(kuò)繁的病原通過蠶業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品和廢棄物等攜帶分布于養(yǎng)蠶區(qū)域環(huán)境中,在適宜條件下通過水平和垂直傳播再侵染家蠶完成其生活史和病原再擴(kuò)展分布(劉吉平等,2000;孫勝,2001;胡必利等,2010;魯興萌等,2016;高興珂等,2021)。

目前生產(chǎn)中根據(jù)微粒子水平和垂直傳播特點(diǎn),制定的防治方法是通過家蠶母蛾微粒子病檢驗(yàn)技術(shù)控制阻斷垂直傳播,養(yǎng)蠶環(huán)節(jié)以防止微粒子水平感染家蠶為主,具體的措施有對(duì)桑葉葉面消毒和防治桑園害蟲以防止家蠶食下野外昆蟲傳播的病原微粒子,飼喂噴灑苯并咪唑類殺菌劑多菌靈的桑葉預(yù)防和治療家蠶微粒子病,洗消家蠶飼喂環(huán)境降低家蠶微粒子密度減少家蠶染病機(jī)率(黃旭華等,2016;廖森泰等,2016),常用的消毒方法是使用含氯消毒劑從養(yǎng)蠶前、中、后全程進(jìn)行大面積洗消,含氯消毒劑由于見光不穩(wěn)定,使用量大且使用周期長(zhǎng),加之對(duì)人和養(yǎng)蠶設(shè)施用具有強(qiáng)烈的刺激性和腐蝕性,一部分消毒液還會(huì)通過徑流或河道進(jìn)入土壤和水體對(duì)微生物、水生植物和動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,破壞土壤和水生態(tài)功能(葉利蘭等,2021)。

為了尋找更多較傳統(tǒng)消毒方法更高效、安全、環(huán)保的靶向性消毒技術(shù),消滅凈化殘存于養(yǎng)蠶環(huán)境和蠶具中病原微粒子(魯興萌等,2013;魯興萌等,2016),本研究開展了溫度、紫外線和消毒劑3種不同消毒方法對(duì)家蠶微粒子病原滅活后染色試驗(yàn)和3齡起蠶添食消毒處理微粒子后的致死和侵染試驗(yàn),現(xiàn)將雙重驗(yàn)證試驗(yàn)報(bào)告如下,以其為蠶業(yè)生產(chǎn)中的微粒子消殺提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試家蠶品種及家蠶微粒子

供試家蠶品種為菁松×皓月,來源于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所,在25℃、L∶D=16∶8條件下用桑葉養(yǎng)至3齡起蠶備用。家蠶微粒子由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所家蠶病研究室保存,添食家蠶發(fā)病后,收集病蠶,研磨過濾后離心得到純化微粒子,用血球計(jì)數(shù)板加無菌水調(diào)整微粒子懸液濃度為108個(gè)/mL備用。

1.2 不同溫度對(duì)家蠶微粒子的活性和致病力影響

試驗(yàn)設(shè)5個(gè)溫度處理40、45、50、55、60℃,取108個(gè)/mL家蠶微粒子懸浮液1 mL分裝至1.5 mL離心管中在水浴鍋中加熱,每個(gè)溫度設(shè)2個(gè)處理時(shí)間30 min和1 h,每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù),微粒子懸浮液常溫處理為陽(yáng)性對(duì)照,使用滅菌水為空白對(duì)照。取不同溫度時(shí)間處理后的微粒子懸液涂片,待未干時(shí)滴加0.1%亞甲基藍(lán)染色1～2 min后顯微鏡檢并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),死粒子被染上不同程度的藍(lán)色,而活粒子不著色,觀察時(shí)每個(gè)視野內(nèi)數(shù)100個(gè)粒子,觀察死亡粒子個(gè)數(shù),計(jì)算死亡率(杜立新等,2018)。

取不同溫度時(shí)間處理微粒子懸液、陽(yáng)性對(duì)照微粒子懸液和陰性對(duì)照滅菌水均勻涂抹于桑葉,晾干后添食3齡餉食家蠶,添食1次病原處理后正常飼養(yǎng),在室溫25℃,L∶D=16∶8條件下飼養(yǎng),每天給桑3次,每處理30頭,每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。飼喂過程中收集死蠶鏡檢感染情況并記錄,添食10 d以后收集剩余的家蠶調(diào)查感染微粒子蟲情況(陳世良等,2018)。

1.3 紫外線對(duì)家蠶微粒子的活性和致病力影響

參照文獻(xiàn)(杜立新等,2018)的方法并作改進(jìn),試驗(yàn)中將108個(gè)/mL微粒子懸浮液分裝至12孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中,每皿加入1 mL,使用20 wx功率的紫外燈照射紫外線,照射距離為50 cm和100 cm,每處理設(shè)4個(gè)照射時(shí)間為6、9、12、15 min,期間每照射1 min攪拌1次培養(yǎng)皿中的微粒子懸浮液,微粒子懸浮液不照射紫外線為陽(yáng)性對(duì)照,滅菌水為空白對(duì)照,每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù),紫外線對(duì)微粒子的染色活性試驗(yàn)和添食家蠶侵染性試驗(yàn)方法參照溫度處理微粒子試驗(yàn)。

1.4 消毒劑對(duì)家蠶微粒子的的活性和致病力影響

參照文獻(xiàn)(黃旭華等,2010)采用微粒子和消毒劑混合法試驗(yàn),取滅菌1.5 mL離心管,每處理取6個(gè)離心管,分別加入經(jīng)搖勻的108個(gè)/mL微粒子懸浮液0.5 mL和消毒劑0.5 mL,使其達(dá)到說明書推薦使用的劑量(三氯異氰脲酸的濃度為800 mg/L、1 600 mg/L、3 200 mg/L,戊二醛癸甲溴銨濃度為67 mg/L、100 mg/L、200 mg/L),微粒子懸浮液加入滅菌水處理為陽(yáng)性對(duì)照,單獨(dú)的滅菌水為空白對(duì)照,分別在振蕩器上輕輕振蕩搖勻、離心、洗凈,再離心,時(shí)間設(shè)為6 min、8 min、12 min(含離心時(shí)間),最后離心得到沉淀后加入滅菌水0.5 mL,振蕩,使孢子充分懸浮備用,消毒劑對(duì)微粒子染色活性試驗(yàn)和添食侵染性影響試驗(yàn)方法參照溫度處理微粒子試驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和DPS 7.05計(jì)算、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度條件處理后對(duì)家蠶微粒子存活和侵染性影響

溫度對(duì)家蠶微粒子的活性和侵染力有顯著影響,隨著試驗(yàn)處理溫度的升高,家蠶微粒子活性和侵染性降低,相同的溫度下處理的時(shí)間越長(zhǎng)家蠶微粒子活性和侵染率越低。家蠶微粒子在40～60℃處理后,微粒子死亡率在25.43%以上,結(jié)合微粒子添食家蠶后的死亡率和侵染率,家蠶微粒子采用55℃以上溫度處理30 min及以上時(shí)間,家蠶微粒子死亡率達(dá)到73.01%以上,對(duì)家蠶侵染率為57.78%以下,添食家蠶后3 d、6 d、10 d的死亡率為55.56%以下,較55℃以下溫度處理呈顯著下降,當(dāng)試驗(yàn)溫度達(dá)到60℃以上,處理時(shí)間為30 min以上時(shí),家蠶微粒子死亡率為100%,對(duì)家蠶侵染率為0(表1)。

表1 在不同溫度條件處理后對(duì)家蠶微粒子存活和侵染力影響

2.2 紫外線照射處理后對(duì)家蠶微粒子存活和侵染力影響

紫外燈不同照射距離下,距離越近微粒子活性越低,對(duì)家蠶侵染率也越低,20 wx功率紫外燈距離50 cm照射后,微粒子死亡率為28.43%～67.13%,添食后對(duì)家蠶的侵染率在0～21.64%,0、3、6、10 d的家蠶最高死亡率為14.10%～34.44%,照射距離為100 cm時(shí),微粒子死亡率為5.33%～37.85%,添食后對(duì)對(duì)家蠶的侵染率在35.68%～100%,0、3、6、10 d的家蠶最高死亡率為33.02%～63.02%。相同照射距離下照射的時(shí)間越長(zhǎng)家蠶微粒子活性越低,對(duì)家蠶侵染率越低,50 cm照射距離下,照射時(shí)間為9 min及以下時(shí)微粒子死亡率為28.43%～37.14%,添食后對(duì)家蠶的侵染率在10.10%～21.64%;當(dāng)照射時(shí)間為12 min及上時(shí)微粒子死亡率為47.70%～67.13%,添食后對(duì)家蠶的侵染率為0,較9 min及以下處理時(shí)間微粒子活性和侵染率顯著降低;照射距離為100 cm時(shí),照射時(shí)間為6 min時(shí)微粒子死亡率為5.33%,添食后對(duì)家蠶的侵染率為100%,當(dāng)照射時(shí)間為9 min及上時(shí)微粒子死亡率為9.17%～37.85%,添食后對(duì)家蠶的侵染率為35.68%～75.82%,較處理6 min時(shí)微粒子活性和侵染率顯著降低(表2)。

表2 紫外線照射后對(duì)家蠶微粒子存活和侵染力影響

2.3 不同消毒劑處理后對(duì)家蠶微粒子存活和侵染力影響

試驗(yàn)所用的2種消毒藥劑處理家蠶微粒子后的出現(xiàn)的死亡率和對(duì)家蠶的侵染率見表3。三氯異氰脲酸800 mg/L及以上濃度,處理6 min及以上時(shí)微粒子死亡率為100%,處理后的微粒子添食家蠶侵染率為0。戊二醛癸甲溴銨67～100 mg/L不同時(shí)間處理對(duì)家蠶微粒子蟲的死亡率介于11.78%～49.18%之間,處理后的微粒子添食家蠶侵染率為31.36%～100%,添食后的家蠶10 d死亡率在33.34%～89.97%,隨著戊二醛癸甲溴銨濃度升高為200 mg/L處理時(shí)間為6 min及以上時(shí)家蠶微粒子蟲的死亡率和侵染率顯著降低,死亡率為100%,處理后的微粒子對(duì)家蠶侵染率為0。

表3 消毒劑對(duì)家蠶微粒子的存活和侵染力影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,3種消毒方式在一定的條件下對(duì)微粒子消殺均表現(xiàn)出較好的效果,但不同消毒方法可應(yīng)用范圍不同。試驗(yàn)中測(cè)定家蠶微粒子的殺滅溫度為60℃處理30 min以上,高溫殺滅微孢子主要是阻礙微粒子裂殖體的發(fā)育和生長(zhǎng)(王璐等,2018),其可作為小型養(yǎng)蠶用具的消毒,如:蠶箔、蠶蔟等;試驗(yàn)中使用的20 wx功率紫外燈距離50 cm照射家蠶微粒子,照射時(shí)間12 min以上,可以有效殺滅微粒子,由于紫外線對(duì)家蠶等生物的遺傳物質(zhì)或免疫系統(tǒng)有影響(黃旭華等,2011),故使用時(shí)只能作為間接消毒方法使用,如對(duì)貯桑室地面角落、上蔟室地面、蠶室墻壁、蠶室門窗、蠶室頂棚等養(yǎng)蠶輔助設(shè)施的表面消毒。消毒劑方面比較了新型的高含氯消毒劑三氯異氰脲酸和醛類銨鹽類混合消毒劑戊二醛癸甲溴銨,三氯異氰脲酸其主要作用機(jī)理是溶解微粒子的細(xì)胞壁后消解其細(xì)胞器使其死亡(黃旭華等,2010),其在800 mg/L及以上濃度,接觸微粒子時(shí)間6 min以上均可以取得很好的消殺效果,含氯類消毒劑是目前蠶業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用時(shí)間最久、范圍最廣、使用量最大的消毒劑,其缺點(diǎn)也較為明顯,如對(duì)家蠶和人有強(qiáng)烈刺激性,對(duì)金屬設(shè)備有強(qiáng)腐蝕性等;戊二醛癸甲溴銨是由醛類消毒劑戊二醛和銨鹽類消毒劑癸甲溴銨混合而成消毒劑,戊二醛癸甲溴銨優(yōu)點(diǎn)是毒性低,見光穩(wěn)定、不易分解,對(duì)金屬腐蝕影響較小,其主要消殺原理是破壞病原物的蛋白質(zhì)和酶活性達(dá)到快速高效的協(xié)同消毒作用(徐秀榮等,2015;王利平等,2021),試驗(yàn)中對(duì)微粒子的消殺濃度為200 mg/L接觸時(shí)間達(dá)到6 min及以上,其可作為蠶業(yè)生產(chǎn)中易受含氯類消毒劑腐蝕的蠶業(yè)設(shè)施和工具消殺微粒子替代使用。本試驗(yàn)中3種消毒方法,均采用了微粒子染色法和添食家蠶法進(jìn)行了雙重驗(yàn)證,其結(jié)果基本都是趨于一致,受限于試驗(yàn)規(guī)模和不同地區(qū)的養(yǎng)蠶環(huán)境,具體的操作條件可以在本試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步摸索完善。