楊開雯，強(qiáng) 鄭，靳文雨，劉 昉

(桂林醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室， 廣西 桂林 541004)

微小RNA(miRNAs)是一種長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的小分子，通過作用于靶基因3′端非編碼區(qū)(untranslated regions，UTR)的特定序列，切割降解靶基因的mRNA分子，調(diào)節(jié)靶基因的翻譯，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)效應(yīng)[1]。有數(shù)據(jù)顯示，miRNAs參與30%～50%基因的表達(dá)調(diào)控[2]。因而 miRNA 靶標(biāo)的檢測(cè)逐漸成為研究 miRNA 功能的重要環(huán)節(jié)。同源性的蛋白質(zhì)激酶3(homeodomain-interacting protein kinases，HIPK3)是一種已知的胰島素分泌調(diào)節(jié)劑，與人類2型糖尿病有關(guān)聯(lián)[3]。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在HIPK3敲除小鼠中出現(xiàn)胰島素分泌受損[4]。先前在糖尿病心肌病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袡z測(cè)到小鼠心臟的miR- 146水平顯著降低，HIPK3的mRNA水平顯著升高。比對(duì)miRDB 數(shù)據(jù)庫和DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR- 146與HIPK3基因 3′UTR可能存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。因此，推測(cè)，HIPK3有可能是miR- 146的靶基因。本研究通過構(gòu)建HIPK3基因3′UTR野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告載體，分析miR- 146a mimics和miR- 146b mimics對(duì)含有野生型和突變型HIPK3基因3′UTR的雙熒光素酶報(bào)告載體活性的影響，為后續(xù)深入探討miR- 146及HIPK3在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

miR- 146a mimic、miR- 146b mimic、NC片段和PCR引物 (廣州銳博公司)；人胚胎腎上皮細(xì)胞系- 293T細(xì)胞(上海銳賽公司)；psicheck2質(zhì)粒、DMEM和轉(zhuǎn)染試劑POLO3000(上海銳賽公司)；Trizol、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)；SYBR Green mix(諾維贊公司)；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶基因預(yù)測(cè)：miRDB 數(shù)據(jù)庫和DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)交叉結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)miR- 146與HIPK3可能的靶向結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測(cè)結(jié)果取交集。

1.2.2 熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建：根據(jù)HIPK3基因的3UTR區(qū)序列設(shè)計(jì)并合成PCR 引物，HIPK3-XhoⅠ-F：5′-TCAGctcgagATACACTGCAAGGTGTAG GAAGATT-3′，HIPK3-PmeⅠ-R：5′-AGTGCgtttaaacTT TGCCGCAATATATATATTTTAATTC-3′，下劃線標(biāo)記為XhoⅠ、PmeⅠ的酶切位點(diǎn)序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度396 bp?；蛉L(zhǎng)的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并用AXGGEN膠回收試劑盒回收目的片段。將目的基因PCR產(chǎn)物和目的載體用XhoⅠ和PmeⅠ分別37 ℃酶切4～5 h后，電泳分離酶切片段，切膠回收目的片段。T4 DNA ligase 連接酶切后的PCR產(chǎn)物及目的載體，并將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含抗性的LB平皿，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，將PCR鑒定呈陽性的克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日抽提質(zhì)粒。應(yīng)用引物(Fm:5′-AGTATTTCTCTCTGTGATTTAAATGTGAC-3′；Rm：5′-CACATTTAAATCACAGAGAGAAATACTATCG-3′)獲得突變質(zhì)粒。將菌落PCR呈陽性的克隆送上海銳賽公司測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為HIPK3-WT(野生型)，HIPK3-MU(突變型)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及miR- 146a mimic、miR- 146b mimic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：用DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行293T細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。轉(zhuǎn)染前24 h，利用胰蛋白酶消化細(xì)胞，接入6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞增值至70%～80%匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。配制轉(zhuǎn)染試劑混合物：A管：取miR- 146a mimic(5 nmol/L)+ miR- 146b mimic(5 nmol/L)2 μL與100 μL基本培養(yǎng)基混勻；B管：6 μL轉(zhuǎn)染試劑與100 μL基本培養(yǎng)基混勻。將B管溶液加入A組各管中，混勻，分別均勻滴加到培養(yǎng)板的細(xì)胞中， 37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。從轉(zhuǎn)染的目的細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，用2-△△Ct法計(jì)算各基因的表達(dá)相對(duì)定量。

1.2.4 海腎熒光目的質(zhì)粒、螢火蟲熒光內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T目的細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前24 h，利用胰蛋白酶消化293T細(xì)胞，接入24孔板中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，從細(xì)胞中移除培養(yǎng)基，換上新鮮的不含抗生素完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育。配制轉(zhuǎn)染試劑混合物：A管：取HIPK3-WT質(zhì)粒(250 ng)和HIPK3-MU質(zhì)粒(250 ng)總量0.5 μg與 25 μL基本培養(yǎng)基混勻；B管：3 μL轉(zhuǎn)染試劑與25 μL基本培養(yǎng)基混勻。將B管溶液加入A組各管中，混勻，取上述轉(zhuǎn)染混合液分別均勻滴加到培養(yǎng)板的細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，收取檢測(cè)樣。各實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組如下： 1)HIPK3-WT + NC陰性對(duì)照；2)HIPK3-WT+miR- 146a mimics；3)HIPK3-WT+miR- 146b mimics；4)HIPK3-MU+NC陰性對(duì)照；5)HIPK3-MU+miR- 146a mimics；6)HIPK3-MU+miR- 146b mimics。各轉(zhuǎn)染組反應(yīng)48 h后，消化細(xì)胞，對(duì)各組的熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 雙熒光素酶活性的檢測(cè)：按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒提供的操作方法，依次加入螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶底物，進(jìn)行熒火蟲熒光素酶(firefly luc)及內(nèi)對(duì)照海腎素?zé)晒馑孛?renilla luc)熒光強(qiáng)度檢測(cè)，計(jì)算firefly luc/renilla luc的比值，并以HIPK3-WT或HIPK3-MU與NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞作對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR- 146與HIPK3靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

miR- 146家族有兩個(gè)成員，分別是miR- 146a和miR- 146b，二者在3′端非種子區(qū)有兩個(gè)不同堿基。通過miRDB和DIANA TOOLS兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的查詢比對(duì)，發(fā)現(xiàn)miR- 146a和miR- 146b都可能靶向HIPK3基因，它們的可能結(jié)合位點(diǎn)都一樣(圖1)。這提示HIPK3極有可能是miR- 146a和miR- 146b的靶基因。

2.2 野生型及突變型重組雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

目的片段的PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為396 bp的HIPK3基因的3′UTR序列(圖2)，連入載體，獲得重組質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證與預(yù)期大小相符(圖3)。HIPK3-WT重組載體進(jìn)行測(cè)序，與DIANA TOOLS中HIPK3基因與miR- 146結(jié)合位點(diǎn)序列一致(圖4)。HIPK3-MU重組載體進(jìn)行測(cè)序可見HIPK3與miR- 146結(jié)合位點(diǎn)缺失(圖5)。

2.3 驗(yàn)證miR- 146a mimic和miR- 146b mimic細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染了miR- 146a mimic和miR- 146b mimic的細(xì)胞中，miR- 146a和miR- 146b表達(dá)顯著升高，說明轉(zhuǎn)染成功(圖6)。

2.5 野生型和突變型重組報(bào)告載體的活性分析

各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性(表1)，共轉(zhuǎn)染miR- 146b mimic和HIPK3-WT(t=4.175，P<0.05)的熒光素酶活性下降，而共轉(zhuǎn)染miR- 146a mimic和野生型HIPK3-WT的熒光素酶活性無明顯變化；另外，共轉(zhuǎn)染miR- 146a mimic和HIPK3-MU的熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR- 146b mimic和HIPK3-MU的熒光素酶活性都沒有出現(xiàn)明顯變化。

A.prediction of the binding site of HIPK3 with miR- 146a; B.prediction of the binding site of HIPK3 with miR- 146b圖1 miR- 146與HIPK3結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)Fig 1 Prediction of the binding site of HIPK3 with miR- 146

1.marker-DL2000; 2-4.HIPK3 3′UTR PCR amplifiction圖2 HIPK3 3′-UTR PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig 2 The results of the HIPK3 3′-UTR PCR amplifiction electrophoresis

1-10.wild type recombinant PCR amplification;11.marker-DL2000圖3 重組野生型載體菌落PCR鑒定Fig 3 Wild type recombinant plasmid colony PCR identification

A.contrast of sequencing between the wild type vector and the target fragment; B.partial sequencing analysisdiagram of wild type vector

A.contrast of sequencing between the mutant vector and the target fragment; B.partial sequencing analysisdiagram of mutation vector

圖6 qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR- 146a和miR- 146b的表達(dá)Fig 6 qPCR detects the expression of miR- 146a and miR- 146b after transfection

groupsratiooffluorescenceintensityWT+NC 0881±0026MU+NC 0870±0075WT+miR?146a 0815±0073MU+miR?146a 0740±0051WT+miR?146b 0630±0054?MU+miR?146b 0671±0059

*P<0.05 compared with WT+NC group.

3 討論

miRNAs 是通過對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)并引發(fā)下游一系列的節(jié)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。miR- 146家族有miR- 146a和miR- 146b兩種，二者位于不同的染色體，序列僅在3’端“非種子區(qū)”有兩個(gè)不同堿基。miR- 146在2型糖尿病患者血清中表達(dá)減少是慢性炎性反應(yīng)的標(biāo)志[5]；miR- 146a在糖尿病腎[6]和糖尿病患者的血漿和角膜上皮組織[7- 8]表達(dá)增加，在糖尿病大鼠的坐骨神經(jīng)[9]中下調(diào)；miR- 146b在糖尿病視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)患者中表達(dá)降低[10]，而在人和小鼠的心肌炎[11]、自發(fā)性心肌肥大、心力衰竭小鼠[12]的心臟中表達(dá)明顯上調(diào)。這些研究都顯示出，miR- 146與糖尿病及心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有很大聯(lián)系。

HIPK3在糖尿病小鼠的胰島中高表達(dá)[4]。在前期的實(shí)驗(yàn)中，HIPK3在糖尿病心肌病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋磉_(dá)明顯升高，miR- 146表達(dá)下降，呈現(xiàn)出一種負(fù)相關(guān)關(guān)系。這說明，HIPK3在糖尿病以及其并發(fā)癥的發(fā)病過程中具有重要作用。但是，HIPK3作用于miR- 146的具體靶點(diǎn)還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)HIPK3有可能是miR- 146的下游靶基因，設(shè)計(jì)構(gòu)建野生型和突變型HIPK3基因雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染miR- 146a mimic和HIPK3-WT組的熒光素酶活性無顯著變化，表明miR- 146a與HIPK3基因不具有靶向關(guān)系；共轉(zhuǎn)染miR- 146b mimic和HIPK3-WT組的熒光素酶活性下降，說明miR- 146b能與HIPK3結(jié)合，從而抑制熒光素酶活性。也就是說miR- 146b可以特異性作用于HIPK3基因的 3′UTR位置的 313～320序列，說明miR- 146b對(duì)HIPK3基因有調(diào)控作用。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究 miR- 146b在糖尿病心肌病中的作用提供了部分參考。

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新聞點(diǎn)擊

嬰幼兒使用抗生素過敏癥風(fēng)險(xiǎn)增加

據(jù)英國《BBC新聞》(BBCNEWS)2016- 09- 09報(bào)道，荷蘭最新研究發(fā)現(xiàn)，兩歲以下嬰幼兒服用抗生素會(huì)增加罹患濕疹和花粉癥等過敏問題的風(fēng)險(xiǎn)。

研究人員重新檢視了1966至2015年的22項(xiàng)相關(guān)研究，分析了近40萬患者的數(shù)據(jù)，以尋找抗生素使用與花粉熱、濕疹等過敏癥之間的聯(lián)系。

在英國倫敦舉行的歐洲呼吸學(xué)會(huì)(European Respiratory Society)年度會(huì)議上發(fā)表的研究結(jié)論是，嬰幼兒時(shí)期使用抗生素的人患濕疹的風(fēng)險(xiǎn)較其他人增加15%～41%，患花粉癥的風(fēng)險(xiǎn)則增加14%～56%。接受的抗生素療程時(shí)間越長(zhǎng)，罹上述疾病風(fēng)險(xiǎn)越高。

參與研究的荷蘭Utrecht大學(xué)首席研究員法里巴·阿瑪?shù)显?Fariba Ahmadizar)認(rèn)為，其原因可能在于抗生素會(huì)擾亂人體免疫系統(tǒng)、破壞正常腸道菌群，導(dǎo)致日后接觸無害外來物質(zhì)時(shí)易發(fā)生過敏；此外，抗生素也會(huì)直接削弱人體免疫反應(yīng)。

曾有研究者想找出低齡人群使用抗生素與過敏癥之間的關(guān)聯(lián)，但未能得出一致結(jié)論。學(xué)術(shù)界一直對(duì)發(fā)達(dá)國家人口的過敏率飆升不解，很多人提出可能是童年接觸不同細(xì)菌所致，但確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

未參與研究的英國布里斯托爾大學(xué)(University of Bristol)兒科教授亞當(dāng)·芬恩(Adam Finn)認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了使用抗生素會(huì)有長(zhǎng)期的不良反應(yīng)，醫(yī)學(xué)界之前就對(duì)濫用抗生素導(dǎo)致的抗生素抗藥性表示憂慮。

而另一方面，鑒于抗生素能有效對(duì)抗細(xì)菌感染，挽救了無數(shù)人的生命，芬恩和其他專家也表示，醫(yī)生在使用抗生素時(shí)還須權(quán)衡利弊。