趙 丹，程易塵，吳曉明，羅 瑛，賈舒婷

(昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

DNA甲基化是一種非常重要的表觀遺傳修飾，在基因的表達(dá)調(diào)控、基因組的穩(wěn)定性和發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要的作用[1]。DNA甲基化的維持由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族成員DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)催化完成。DNA甲基化水平的改變，通常與DNMT1密切相關(guān)[3- 4]。而Lipofectamine2000是一種常用的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，廣泛地應(yīng)用于特定基因的表達(dá)和敲低對細(xì)胞影響的研究。而陽離子脂質(zhì)體對細(xì)胞有一定的毒性作用[5]。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000會影響細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)，Lipofectamine2000對細(xì)胞的毒性作用可能是通過DNMT1實(shí)現(xiàn)的。因此本研究通對DNMT1在Lipofectamine2000處理Hela和395- 9B- 1(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)細(xì)胞不同時間后的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并探討Lipofectamine2000對細(xì)胞的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料:HeLa細(xì)胞、395- 9B- 1細(xì)胞、胎牛血清和胰蛋白酶(Amresco公司)；DMEM (Life Technologies公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；5Aza(5-氮雜-2’-脫氧胞苷，Sigma公司)；DNMT1和beta-actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理:將細(xì)胞置于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa和395- 9B- 1細(xì)胞，細(xì)胞覆蓋率為90%時傳代，達(dá)到70%～80%用Lipo2000處理。具體步驟為：將20 μL Lipofectamine2000加入3 mL OPti-DMEM培養(yǎng)基中室溫孵育25 min。吸除細(xì)胞培養(yǎng)液并用PBS清洗。將上述混合液加入培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換DMEM培養(yǎng)基終止處理，分別于處理后24、48及72 h和7 d收集細(xì)胞沉淀， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?Aza處理細(xì)胞作為陽性對照。

1.2.2 RT-RCR檢測DNMT1的mRNA表達(dá):收集細(xì)胞沉淀后，用Trizol提取總RNA，以O(shè)ligo-d(T)引物GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒(Promega公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到CDNA。實(shí)驗方法參照產(chǎn)品說明書。引物序列，DNMT1 正向引物5′-CCGTGGCTACGAGGAGAAC-3′，反向引物5′-TTGGGTTTCCGTTTAGTGGGG-3′；beta-actin正向引物5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反向引物5′-CAATAGTG ATGACCTGGCCGT-3′。

1.2.3 檢測DNMT1蛋白表達(dá):取適量上述細(xì)胞沉淀提取蛋白，每孔加入15 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(電泳條件：恒壓140 V 1.5 h)。再用300 V、180 mA濕轉(zhuǎn)3.5 h至硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。再加入相應(yīng)一抗室溫反應(yīng)3 h，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，后加入相應(yīng)二抗，室溫反應(yīng)2 h，用TBST洗滌6次，每次5 min。最后用顯影液處理1 min后用全自動洗片機(jī)進(jìn)行顯影后的成像。

2 結(jié)果

2.1 Lipofectamine2000處理影響HeLa細(xì)胞的狀態(tài):Lipofectamine2000處理后24 h細(xì)胞變長，至72 h這一現(xiàn)象更加明顯，并且細(xì)胞外膜有向外延伸的狀態(tài)，而7 d后細(xì)胞形狀基本恢復(fù)到原先狀態(tài)(圖1)。

2.2 HeLa細(xì)胞中DNMT1的mRNA表達(dá)量:Lipofectamine2000處理HeLa細(xì)胞48 h后，DNMT1 mRNA降低；處理后7 d，DNMT1 mRNA明顯升高(圖2)。

2.3 Lipofectamine2000處理影響HeLa細(xì)胞中DNMT1蛋白的表達(dá):經(jīng)Lipofectamine2000處理HeLa細(xì)胞48 h后DNMT1蛋白水平的表達(dá)顯著降低，72 h后有回升的趨勢(圖3)。

2.4 Lipo2000處理影響395- 9B- 1細(xì)胞中DNMT1的表達(dá):用Lipo2000處理395- 9B- 1細(xì)胞后5 d，細(xì)胞中DNMT1蛋白有持續(xù)升高的趨勢(圖4)。

圖1 HeLa細(xì)胞形態(tài)圖Fig 1 The morphology of HeLa cells

*P<0.05 compared with control圖2 HeLa細(xì)胞中DNMT1的mRNA表達(dá)水平Fig 2 mRNA expression level of DNMT1 in HeLa

圖4 395- 9B- 1細(xì)胞中DNMT1蛋白表達(dá)變化Fig 4 The protein expression of DNMT1 in 395- 9B- 1 cells

A.Western blot results; B.quantitative chart of Western blot;*P<0.05 compared with control；△P<0.05 compared with 48 hours

3 討論

HeLa細(xì)胞是實(shí)驗中最常用的一種人源模式細(xì)胞，廣泛的應(yīng)用于各種研究。Lipofectamine2000對細(xì)胞是有一定毒性的，而其具體的原因目前還不是很清楚。本研究發(fā)現(xiàn)這一毒性在Hela細(xì)胞中可能是通過對DNMT1蛋白水平的短期抑制改變細(xì)胞的表觀遺傳修飾來實(shí)現(xiàn)。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的實(shí)驗結(jié)果表明，Lipofectamine2000對細(xì)胞DNNT1表達(dá)的影響可能具有普遍性，為Lipofectamine2000的細(xì)胞毒性研究提供一個新的視角。

[1] Lorincz MC, Dickerson DR, Schmitt M,etal. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells[J]. Nat Struct Mol Biol, 2004, 11: 1068- 1075.

[2] Goll MG, Bestor TH. Eukaryotic cytosine methyltrans-ferases[J]. Annu Rev Biochem, 2005, 74:481- 514.

[3] Rhee I, Bachman KE, Park BH,etal. DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells[J]. Nature, 2002, 416: 552- 556.

[4] Zhi D, Zhang S, Cui S,etal. The headgroup evolution of cationic lipids for gene delivery[J]. Bioconjugate Chem, 2013, 24: 487- 519.

新聞點(diǎn)擊

出汗過多影響心理健康

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 14)報道，一項新研究指出，多汗癥(出汗過多癥狀)伴發(fā)有焦慮癥與憂郁癥的比例似乎也比一般人高一些。

研究發(fā)現(xiàn)，多汗癥篩檢陽性的人罹患焦慮癥與憂郁癥的概率分別為21%和27%，而其他患者檢出率分別為7.5%和10%以下。

這個研究結(jié)果并未證明多汗癥會導(dǎo)致哪些心理健康問題，因此，這個結(jié)果并不代表將多汗癥控制得較好會舒緩人們憂郁癥或焦慮癥的情況。但皮膚科醫(yī)生應(yīng)該了解，這些患者有焦慮癥或憂郁癥的概率較高。

然而，有多汗癥的人通常會有自我意識避免社交活動，甚至像在課堂上舉手這些平凡的事情。

研究人員建議，多汗癥患者應(yīng)該與醫(yī)生討論心理健康的問題。

該研究結(jié)果刊登在2016年12月《美國皮膚科學(xué)會雜志》。

低糖飲食對代謝有益

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 09)報道，有篇小型研究指出，吃低糖餐會對女性的代謝健康有益，若吃高糖餐則不會有這種改變。

研究人員發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動時間對代謝的益處起了很大的作用。

這篇研究顯示，當(dāng)人們24 h內(nèi)的三餐只含有30%的碳水化合物時，他們的餐后胰島素抵抗以及胰島素含量會降低30%。

當(dāng)人們在24 h內(nèi)的三餐含有60%碳水化合物，胰島素抵抗或胰島素含量就沒有降低這么多。

正常來說，運(yùn)動被認(rèn)為有助于降低胰島素抵抗，降低血糖值；但這篇研究結(jié)果顯示，在吃東西以前運(yùn)動確實(shí)增加女性夜間血糖值。

Borer解釋，運(yùn)動時需要能量，誘發(fā)激素作用，讓肝糖元釋放出來。身體大部分出現(xiàn)組織胰島素抵抗，允許大腦以及肌肉使用多余的糖類。如果組織沒有使用完所有的糖類，血糖就會維持在很高的狀態(tài)。

然而，吃飯后運(yùn)動消耗的熱量就是餐點(diǎn)所提供的能量，而不是由肝臟提供；建議在吃完飯后40 min內(nèi)運(yùn)動。

Borer指出，這篇研究的對象只是健康的女性，而且研究是短期的，不能評價低糖飲食以及運(yùn)動是如何影響某些糖尿病前期或2型糖尿病患者。