閆 飛 劉萍萍 張 鍵 趙 瑞 倪文鵬 李倩如 杜 英

(鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系,鄭州 450001)

叉頭蛋白O1(Forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在許多組織表達，參與細胞凋亡、DNA損傷修復、腫瘤發(fā)生和糖代謝等重要生命過程[1，2]。文獻資料顯示，F(xiàn)oxO1表達量在T、B淋巴細胞和卵巢組織顯著高于其他組織[3]，提示FoxO1在這些組織和細胞中有更為重要的作用。研究已發(fā)現(xiàn)FoxO1在T細胞中有三個重要的靶基因，即編碼IL-7Rα亞單位(IL-7Rα)、L-選擇素(CD62L)和KLF2(Kruppel-like factor 2)的基因[4]，F(xiàn)oxO1能通過IL-7Rα和KLF2調(diào)節(jié)初始T細胞生存和歸巢[5]。KLF2能進一步調(diào)節(jié)鞘胺醇-1-磷酸受體(Sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1P1)、CD62L、CCR7等分子在細胞的表達[6]，其中S1P1和CD62L是調(diào)節(jié)淋巴細胞在血液循環(huán)和外周免疫器官分布的重要分子，也是T細胞在胸腺分化成熟的重要標志[7-9]。我們在對重癥肌無力(Myasthenia gravis，MG)患者胸腺細胞異常分化的研究中，發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺組織中FoxO1、KLF2和S1P1 mRNA和蛋白表達水平均顯著高于對照組[10]，但這些分子在MG患者胸腺中高表達在疾病發(fā)生和胸腺細胞亞群異常中的作用尚不清楚，為探討FoxO1高表達對胸腺細胞和T細胞功能的影響，我們采用分子生物學技術(shù)構(gòu)建了人FoxO1表達和干擾(shRNA)慢病毒載體，通過轉(zhuǎn)染Jurkat細胞(人急性T細胞白血病細胞)人為造成FoxO1高表達和低表達細胞模型，分析FoxO1對下游分子KLF2、S1P1、CD62L、CCR7分子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 FoxO1cDNA購于北京義翹神州生物；T4 DNA Ligase、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、Marker、SYBR?Primix Ex Tap，均購自日本TaKaRa公司；DL2000、DL5000，Clon Express Multis One Step Cloning Kit購于南京Vazyme公司；KOD-Plus-Neo購于日本Toyobo公司；載體質(zhì)粒pCDH-CMV-EF1-copGFPGFP購于上海生物風公司；載體質(zhì)粒pMAGi1.1、HEK293T細胞和Jurkat細胞，由鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗中心贈送；包裝質(zhì)粒pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.2 dvpr購于Addgene公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和NotⅠ，Western blot蛋白marker為PageRulerTMPrestained Protein Ladder(10～180 kD)購于美國Therm公司；限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ購于日本TaKaRa公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于美國Axygen公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購于北京鼎國昌盛生物科技有限公司；FoxO1抗體和KLF2抗體購于英國Abcom公司；CD4、CD8、S1P1、CCR7和CD69抗體購于美國BD公司；CD62L抗體購于美國Biolengd公司。

1.2實驗方法

1.2.1引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中人FoxO1 cDNA(NM-005438.4)序列設(shè)計帶酶切位點的FoxO1引物：FoxO1-F-XbaⅠ：5′-gattctagagctagcgaattc ATGGCCGAGGCGCCTCAG-3′；FoxO1-R-NotⅠ：5′-gatccttgcggccgcggatcc TCAGCCTGACACCCAGCTATG-3′，由蘇州金唯智公司合成。FoxO1-shRNA序列：序列1：CCGGGGAGAAGAGCTGCATCCATTTCAAGAGAATG-GATGCAGCTCTTCTCCTTTTTTG；序列2：AATTCA-AAAAAGGAGAAGAGCTGCATCCATTCTCTTGAAAT-GGATGCAGCTCTTCTCC。

1.2.2目的基因擴增 以FoxO1 cDNA為模板，PCR擴增帶酶切位點的基因片段。反應體系為：10×Buffer 5 μl ，2 mmol/L dNTPs 5 μl，25 mmol/L MgSO42 μl，10 μmol/L FoxO1-F-XbaⅠ/FoxO1-R-NotⅠ 1.5 μl，cDNA 1 μl(10 ng)，滅菌去離子水33 μl，KOD-Plus-Neo 1 μl，總體積50 μl。PCR反應條件：94℃ 2 min；98℃ 10 s，57℃ 30 s，68℃ 2 min，38循環(huán)；68℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和膠回收，得到帶酶切位點的FoxO1片段。

1.2.3質(zhì)粒的重組、擴增和鑒定 將pCDH-CMV-EF1-copGFP質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和NotⅠ雙酶、電泳和回收，與FoxO1片段連接，得到pCDH-CMV-EF1-copGFP-FoxO1表達質(zhì)粒。FoxO1-shRNA序列退火形成雙鏈，AgeⅠ+EcoRⅠ酶切載體pMAGic 1.1，兩者以T4連接酶連接，得到pMAGic 1.1-FoxO1-shRNA干擾質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α細菌，并進行陽性克隆篩選、PCR擴增和測序鑒定。

1.2.4慢病毒包裝和滴度檢測 將上述重組質(zhì)粒20 μg(表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒)分別與pCMV-dR8.2 dvpr 12 μg、pCMV-VSV-G 10 μg混勻，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜、換液，48 h和72 h觀察熒光，收集上清。采用有限稀釋法進行慢病毒滴度檢測，病毒滴度=GFP+細胞數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.2.5慢病毒載體感染Jurkat細胞 Jurkat細胞按1.25×105個/孔接種于24孔板，感染指數(shù)MOI=30，Polybrene=4 μg/ml。試驗分組：FoxO1過表達組(FoxO1-overexpression group,感染表達慢病毒)、低表達組(FoxO1-inteferece group,感染干擾慢病毒)、對照組(control group,感染不含F(xiàn)oxO1表達基因或干擾基因的慢病毒)。

1.2.6熒光定量PCR 收集各組Jurkat細胞，Trizol法提取總RNA,按照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR，使用ABI7500Fast Real-time PCR System檢測和分析FoxO1、S1P1、CCR7、CD62L和CD69 mRNA水平。

1.2.7Western blot 收集各組細胞，經(jīng)RIPA裂解液提取細胞總蛋白，100℃水浴變性，依次經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉、一抗4℃孵育過夜和二抗室溫孵育2 h后，用化學發(fā)光法在Bio-Rad凝膠成像儀上拍照，檢測FoxO1、磷酸化的FoxO1(p-FoxO1)和KLF2蛋白表達水平。

1.2.8流式細胞術(shù) 收集各試驗組細胞，分別加入PE標記的CCR7單抗、CD62L單抗，eFluor660或APC標記的S1P1、CD69單抗，每組2個重復孔，并設(shè)同型抗體對照，上流式細胞儀(BD Accuri-C6)檢測并分析細胞表面S1P1、CCR7、CD62L和CD69分子表達。

2 結(jié)果

2.1FoxO1重組質(zhì)粒的鑒定 兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌后，隨機挑取菌落進行質(zhì)粒提取、PCR擴增和電泳，觀察到5個表達質(zhì)粒電泳結(jié)果均為陽性，9個干擾質(zhì)粒中有2、4和6號為陽性，如圖1。選取陽性菌落進行質(zhì)粒提取并測序，經(jīng)NCBI-blast驗證確定重組陽性克隆。

2.2表達和干擾慢病毒對Jurkat細胞的感染效率 兩種慢病毒載體分別感染Jurkat細胞120 h后，于熒光倒置顯微鏡下觀察GFP熒光，計數(shù)，感染效率>70%，如圖2。

圖1 FoxO1重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.1 Results of FoxO1 recombinant plasmid identification

圖2 Jurkat細胞感染慢病毒載體后120 h熒光倒置顯微鏡下GFP表達情況Fig.2 GFP expression in Jurkat cells under Fluorescence Inversion Microscope System after infection of 120 hNote:n=6.

2.3FoxO1基因?qū)ζ湎掠畏肿觤RNA在Jurkat細胞表達的影響 FoxO1基因轉(zhuǎn)染120 h， 結(jié)果如圖3所示過表達組FoxO1(35.25±0.94)、KLF2(1.81±0.51)、S1P1(1.42±0.16)和CD62L(1.61±0.11)mRNA水平均顯著增高(P<0.05)；CCR7(0.95±0.17)和CD69(1.12±0.12)未見改變(P>0.05)；干擾組FoxO1(0.69±0.13)、 KLF2(0.52±0.07)、 S1P1(0.20±0.02)和CD62L(0.50±0.08)降低(P<0.05)，CD69(6.58±3.30)升高(P<0.05)，CCR7(2.66±1.09)未見改變(P>0.05)。

2.4FoxO1基因?qū)oxO1、p-FoxO1和KLF2蛋白水平的影響 如圖4所示，F(xiàn)oxO1表達載體感染Jurkat細胞120 h后，F(xiàn)oxO1、p-FoxO1 和KLF2均高于對照組；干擾載體轉(zhuǎn)染在72 h(圖6A)和120 h后Jurkat細胞p-FoxO1、 FoxO1和KLF2低于對照組，干擾載體轉(zhuǎn)染120 h比72 h時Jurkat細胞p-FoxO1、 FoxO1和KLF2表達抑制更顯著。

圖3 Jurkat細胞感染FoxO1慢病毒感染120 h后mRNA表達的變化Fig.3 Change of mRNA level in Jurkat cells after infection of 120 hNote:n=6;*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.000 1.

圖4 Jurkat細胞FoxO1慢病毒感染120 h后，F(xiàn)oxO1、p-FoxO1和KLF2蛋白水平的改變Fig.4 Change of FoxO1，p-FoxO1 and KLF2 expression in Jurkat cells after infection of 120 hNote:n=6.

圖5 過表達組在感染120 h后，GFP+Jurkat細胞S1P1、CCR7、CD62L和CD69的改變Fig.5 Change of S1P1,CCR7,CD62L and CD69 expression in GFP+ Jurkat cells after infection of 120 h in FoxO1-overexpression groupNote:n=6;*.P<0.05.

圖6 干擾組在感染72 h后 ，GFP+Jurkat細胞S1P1、CCR7、CD62L和CD69的改變Fig.6 Change of S1P1,CCR7,CD62L and CD69 expression in GFP+ Jurkat cells after infection of 72 h in FoxO1-interference groupNote:A.The result of Western blot;B,C,D.The result of FCM;n=6;*.P<0.05.

圖7 干擾組在感染120 h后，GFP+Jurkat細胞S1P1、CCR7、CD62L和CD69的改變Fig.7 Change of S1P1,CCR7,CD62L and CD69 expression in GFP+ Jurkat cells after infection of 120 h in FoxO1-interference group Note:n=6;*.P<0.05.

2.5FoxO1基因?qū)urkat細胞S1P1、CD62L分子表達的影響 流式細胞分析結(jié)果顯示：表達載體轉(zhuǎn)120 h后，S1P1+細胞(4.72±1.14)和CD62L+細胞(79.03±0.03)百分比與對照組(分別為2.70±0.03，68.74±0.79)相比顯著升高(P<0.05)，CD69+染細胞和CCR7+細胞百分比無顯著變化(P>0.05)；S1P1和CD62L在平均熒光強度方面并沒有顯著改變(P>0.05),如圖5。干擾載體轉(zhuǎn)染72 h，S1P1+細胞(6.98±1.95)和CD62L+( 86.22±0.35)細胞百分比顯著下降(對照組分別為15.12±1.13和92.20±0.25)P<0.05，CD69+細胞百分比(1.21±0.3)顯著高于對照組(0.09±0.06)，P<0.05，CCR7+細胞百分比未見改變；S1P1和CD62L在平均熒光強度方面并沒有顯著改變(P>0.05),如圖6；至120 h S1P1+細胞(24.71±0.52)和CD69+細胞(2.59±0.46)呈現(xiàn)出增高趨勢，與對照組(分別為4.02±0.87和0.05±0.1，P<0.05)相比顯著升高，CD62L+細胞水平恢復至轉(zhuǎn)染前水平，CCR7+細胞百分比未見改變；S1P1和CD62L在平均熒光強度方面并無顯著改變(P>0.05),如圖7。

3 討論

在哺乳類動物中，轉(zhuǎn)錄因子FoxO1高表達于成熟的T、B淋巴細胞[3]，在促進T細胞靜默和維持外周耐受方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，T細胞進入血-淋巴循環(huán)必須有FoxO1滅活，F(xiàn)oxO1的缺陷將導致T細胞持續(xù)活化和自身免疫病[11]。FoxO1通過促進外周調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的發(fā)育和功能而防止自身免疫病的發(fā)生[12]，細胞體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)FoxO1具有調(diào)節(jié)CD8+記憶T細胞分化的作用[11]，Ouyang等[13]利用綠色熒光蛋白報告基因研究發(fā)現(xiàn)，未成熟胸腺細胞低表達FoxO1，分化成熟的胸腺細胞FoxO1表達顯著增加，尤其在胸腺Treg比一般CD4單陽性細胞FoxO1增高更加顯著，與外周T細胞的FoxO1表達量相似。因此，F(xiàn)oxO1在T細胞分化成熟及T細胞功能等方面均具有重要作用，而且FoxO1可被磷酸化為p-FoxO1，由細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，從而轉(zhuǎn)錄功能受到抑制[5]。本文中，我們成功構(gòu)建了慢病毒FoxO1表達載體和干擾載體，通過感染Jurkat細胞，人為造成FoxO1和p-FoxO1整體水平的過表達和低表達，觀察到FoxO1在Jurkat細胞過表達引起一系列FoxO1下游分子(包括KLF2、S1P1和CD62L)mRNA和蛋白表達水平均升高，這與上述文獻結(jié)果一致。在FoxO1下游分子中，S1P1是一種G蛋白偶聯(lián)受體，其配體1-磷酸鞘氨醇(S1P)由血管內(nèi)皮細胞等分泌，能介導成熟胸腺細胞離開胸腺進入外周[14,15]，也同樣介導成熟淋巴細胞從外周淋巴組織進入血液。CD62L又稱L-選擇素，其配體主要為內(nèi)皮細胞和白細胞表面的寡糖基團，與S1P1一起共同影響淋巴細胞的遷移功能。

在FoxO1表達干擾組中，Jurkat細胞在轉(zhuǎn)染72 h 表現(xiàn)為KLF2、S1P1和CD62LmRNA和蛋白水平的降低，但在120 h僅出現(xiàn)KLF2 mRNA水平及Western blot結(jié)果蛋白水平的降低，而流式結(jié)果與之不符，表現(xiàn)為S1P1+細胞升高，推測其原因是FoxO1基因表達受到干擾后早期可能出現(xiàn)S1P1+細胞的減少，隨著細胞自身調(diào)節(jié)作用而使S1P1+細胞增多，提示該干擾表達載體僅在短期發(fā)揮作用。

文獻報道已顯示出FoxO1-KLF2-S1P1在調(diào)節(jié)T細胞發(fā)育、分化成熟和遷移、功能活性過程中的重要作用[16,17]，我們構(gòu)建的慢病毒FoxO1表達載體和干擾載體能有效調(diào)節(jié)Jurkat細胞KLF2、S1P1和CD62L等分子的表達，為開展T細胞、胸腺細胞等細胞內(nèi)FoxO1-KLF2-S1P1信號通路調(diào)控和細胞相關(guān)功能的研究打下了基礎(chǔ)。

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