王英歌 梁景巖 陳 露 潘 陽(yáng) 張雨蒙 何凱明

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225001)

鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病(Calcific aortic valve disease，CAVD)包括病變?cè)缙诘闹鲃?dòng)脈瓣硬化和晚期的主動(dòng)脈瓣狹窄，是心臟科的常見(jiàn)病，該病往往最終導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣鈣化的病理過(guò)程[1，2]。CAVD和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化有相似的危險(xiǎn)因素，包括年齡、吸煙、高血壓和高脂血癥[3]；而CAVD病變的早期瓣膜組織病理改變?cè)诤芏喾矫嬉才c冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變類(lèi)似。然而CAVD的發(fā)生機(jī)制仍不十分明確。已經(jīng)證實(shí)的是脂質(zhì)滯留、脂質(zhì)氧化和脂蛋白(a){LP(a)}參與了CAVD的發(fā)生過(guò)程[3-5]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK9)是否參與CAVD的發(fā)生過(guò)程尚不得而知。本研究擬探討血漿PCSK9水平與CAVD發(fā)生的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 通過(guò)經(jīng)胸心臟彩超篩選2015年3月～2016年9月本院CAVD患者120例及陰性對(duì)照組患者40例。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡大于60歲，曾進(jìn)行心臟彩超和心臟雙源CT檢查(2種檢查間隔不超過(guò)2個(gè)月)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1月內(nèi)使用過(guò)他汀類(lèi)藥物，明確診斷的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、先天性二葉主動(dòng)脈瓣疾病、嚴(yán)重的二尖瓣狹窄或鈣化、嚴(yán)重的二尖瓣或主動(dòng)脈瓣返流、風(fēng)濕性心臟病、心力衰竭、現(xiàn)患感染性疾病、中重度腎功能不全、現(xiàn)患或慢性肝臟疾病、酗酒或嗜藥史。本研究遵守赫爾辛基宣言并已通過(guò)我院倫理委員會(huì)倫理審查。

1.2方法

1.2.1雙源CT評(píng)價(jià)主動(dòng)脈瓣 所有患者通過(guò)CT檢查進(jìn)一步對(duì)主動(dòng)脈瓣鈣化程度進(jìn)行評(píng)估。CT檢查使用西門(mén)子公司雙源CT掃描機(jī)，鈣化掃描采用前瞻性心電門(mén)控觸發(fā)技術(shù)。掃描參數(shù):采用2×32×0.6層厚、旋轉(zhuǎn)時(shí)間330 ms、管電壓100～120 kV、管電流320 mA進(jìn)行掃描。在圖像后處理工作站對(duì)所有圖像進(jìn)行重建，層厚0.5 mm，重建間距0.3 mm。由2名有經(jīng)驗(yàn)的CT醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。主動(dòng)脈瓣鈣化定義為鈣化病變位于主動(dòng)脈瓣瓣葉或累及主動(dòng)脈根部，表現(xiàn)為斑塊在連續(xù)3個(gè)以上像素的密度大于130 HUs。首先，通過(guò)CT定量評(píng)分系統(tǒng)對(duì)主動(dòng)脈瓣鈣化進(jìn)行分組：AVC 1級(jí)，主動(dòng)脈瓣無(wú)鈣化；AVC 2級(jí)，主動(dòng)脈瓣輕度鈣化，表現(xiàn)為小的孤立的點(diǎn)狀鈣化灶；AVC 3級(jí)，主動(dòng)脈瓣中度鈣化，表現(xiàn)為多個(gè)大的鈣化點(diǎn)或鈣化灶；AVC 4級(jí)，嚴(yán)重鈣化，表現(xiàn)為所有瓣葉彌漫性鈣化[6]。其次利用鈣化積分分析軟件對(duì)瓣膜鈣化進(jìn)行分析，計(jì)算鈣化積分分值。每個(gè)病變的鈣化積分為鈣化體積乘以最大灰度值[7]，所有病變的鈣化積分之和記為鈣化總積分。

1.2.2生化指標(biāo)檢測(cè) 根據(jù)本課題組前期研究和相關(guān)研究的資料查詢，確定相關(guān)性分析時(shí)的生化指標(biāo)?？崭共裳糜贓DTA管中，3 000 r/min離心15 min，取血漿凍存于-80℃冰箱中備用?？偰懝檀?TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、載脂蛋白A1(Apo A1)及載脂蛋白B(Apo B)、LP(a)和高敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)均使用羅氏c701生化分析儀測(cè)定。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的方法檢測(cè)血漿PCSK9水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料應(yīng)用t檢驗(yàn)或者方差分析，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。對(duì)于不符合正態(tài)分布的TG、Apo A1、LP(a)、hsCRP和PCSK9行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，相關(guān)性采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者的一般情況和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較 所有患者的平均年齡為(69.1±6.4)歲，男性94例(58.8%)，女性66例(41.2%)。52.5%患者合并高血壓，26.3%合并糖尿病，40.0%吸煙。與對(duì)照組(AVC1級(jí))比較，AVC 2～4級(jí)在年齡、男性比例、吸煙、高血壓、糖尿病方面組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4組患者藥物的使用亦無(wú)差別(P>0.05)。4組患者左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4組患者主動(dòng)脈瓣鈣化積分為(0.048.6±14.5)、(114.5±37.7)及(427.8±210.3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。4組患者LDL-C、Apo B和Lp(a)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AVC 2～4級(jí)患者明顯高于AVC1級(jí)，而TG、HDL-C、Apo A1和反應(yīng)炎癥的指標(biāo)hsCRP組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較AVC 3級(jí)和AVC 4級(jí)的TC水平高于AVC 1級(jí)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，AVC 2～4級(jí)組患者血漿PCSK9水平高于AVC1級(jí)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與主動(dòng)脈瓣鈣化積分的相關(guān)性 將所有人群的主動(dòng)脈瓣鈣化積分和生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其與TC (r=0.248,P=0.026)，LDL-C (r=0.222,P=0.048)、Lp(a)(r=0.276,P=0.013)、PCSK9(r=0.309,P=0.005)、Apo A1(r=0.245,P=0.012)、Apo B(r=0.212,P=0.019)均存在明顯相關(guān)性。但是對(duì) CAVD 患者的分析發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈瓣鈣化積分與以上指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性。另外hsCRP與主動(dòng)脈瓣鈣化積分之間無(wú)相關(guān)性。PCSK9與TC、LDL、 LP(a)、 Apo A1、Apo B呈正相關(guān)，但與hsCRP無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表2。

表14組患者基線情況對(duì)比

Tab.1Baselinecomparisonof4groupsofpatients

ProjectAVC1level(n=20)AVC2level(n=18)AVC3level(n=29)AVC4level(n=13)PAge(years)67 8±5 169 7±6 168 5±7 171 5±6 40 391Male[n(%)]18(45 0)26(72 2)34(58 6)16(61 5)0 399Smoke[n(%)]12(30 0)12(33 3)26(44 8)14(53 8)0 478Hypertension[n(%)]16(40 0)16(44 4)34(58 6)18(69 2)0 306Diabetes[n(%)]10(25 0)6(16 7)16(27 6)10(38 5)0 594Theuseofdrugs[n(%)]ACEI/ARB6(15 0)14(38 9)16(27 6)12(46 2)0 211beta?blockers4(10 0)10(27 8)6(10 3)6(23 1)0 318Calciumantagonists6(15 0)8(22 2)10(17 2)4(15 4)0 939Diuretic4(10 0)4(11 1)6(10 3)6(23 1)0 660Aspirin10(25 0)18(50 0)12(20 7)8(30 8)0 182echocardiographyLVDD(mm)50 9±3 451 2±2 652 5±2 652 1±3 60 223LVEF(%)62 1±5 161 2±4 259 6±4 959 8±5 20 300DSCTparameterAorticvalvecalcificationscore048 6±14 5114 5±37 7427 8±210 3<0 001

Note：ACEI/ARB.Angiotensin converting enzyme inhibitor/angiotensin receptor antagonist；LVDD.Left ventricular end diastolic diameter；LVEF.Left ventricular ejection fraction；DSCT.Dual source CT.

表2實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與主動(dòng)脈瓣鈣化積分的相關(guān)性(Pearson相關(guān)分析)

Tab.2Correlationbetweenlaboratoryindexesandaorticvalvecalcificationscore(Pearsoncorrelationanalysis)

ProjectAllresearchpopulation(n=160)CAVDpatients(n=120)TC0 2481)0 166LDL?C0 2221)0 111Lp(a)0 2761)0 210PCSK90 3092)0 235hsCRP0 028-0 034ApoA10 2450 153ApoB0 2120 129

Note：Lp (a) and PCSK9 were analyzed by logarithmic transfor-mation.TC.Total cholesterol；LDL-C.Low density lipoprotein cholesterol；Lp(a).Lipoprotein(a)；PCSK9.Proprotein convertase subtilisin/Kexin 9；hs-CRP.High sensitive C reactive protein；Apo A1.Apolipoprotein-A1；Apo B.Apolipoprotein-B，1)P<0.05，2)P<0.01.

表3PCSK9與TC，LDL-C，Lp(a)和hsCRP相關(guān)性分析(Pearson相關(guān)分析)

Tab.3CorrelationanalysisbetweenPCSK9andTC,LDL-C,Lp(a)andhsCRP(Pearsoncorrelationanalysis)

ProjectrPTC0 535<0 001LDL0 470<0 001Lp(a)0 489<0 001hsCRP-0 106>0 05ApoA10 392<0 001ApoB0 431<0 001

Note：Lp (a) and PCSK9 were analyzed by logarithmic transform-ation.TC.Total cholesterol；LDL-C.Low density lipoprotein cholesterol；Lp(a).Lipoprotein(a)；PCSK9.Proprotein convertase subtilisin/Kexin 9；hs-CRP.High sensitive C reactive protein；Apo A1.Apolipoprotein-A1；Apo B.Apolipoprotein-B.

2.4PCSK9 與生化指標(biāo)相關(guān)性分析 PCSK9與TC、LDL、LP(a)、Apo A1、Apo B呈正相關(guān)，然而PCSK9與hsCRP無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表3。

3 討論

CAVD包括早期的以瓣膜增厚、纖維化和微鈣化為主要表現(xiàn)的主動(dòng)脈瓣硬化和晚期的主動(dòng)脈瓣狹窄[8]。CAVD的早期病理過(guò)程包括脂質(zhì)浸潤(rùn)、炎癥反應(yīng)等，與冠狀動(dòng)脈的粥樣硬化過(guò)程存在很多相似點(diǎn)[8]。但是CAVD的發(fā)病機(jī)理、病理過(guò)程和藥物干預(yù)的時(shí)機(jī)仍不明確。

PCSK9參加降解LDL受體，在LDL-C代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。PCSK9屬于系統(tǒng)分泌蛋白，可以結(jié)合LDL受體并將其運(yùn)至溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解。PCSK9可以在人類(lèi)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中檢測(cè)到，提示PCSK9可能同脂質(zhì)、氧化脂質(zhì)一樣參與了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[9]。平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均在動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)展中起重要作用。研究表明，平滑肌細(xì)胞的PCSK9有活性，其可以降低巨噬細(xì)胞上LDL受體數(shù)量，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PCSK9在泡沫細(xì)胞的形成及動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展中發(fā)揮直接作用[10]。另外，動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)PCSK9的小鼠在高膽固醇飲食處理下容易會(huì)罹患主動(dòng)脈瓣鈣化[11]。因此，研究者推測(cè)PCSK9 參與主動(dòng)脈瓣的鈣化啟動(dòng)過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，血漿LDL-C、TC和LP(a)在主動(dòng)脈瓣鈣化患者中明顯增高，與既往多數(shù)研究的結(jié)果一致[12,13]。另外,LP(a)水平與PCSK9水平存在正相關(guān)。有研究證實(shí)PCSK9 通過(guò)LDL受體調(diào)節(jié)LP(a)的分解代謝。PCSK9可以明顯降低肝臟HepG2細(xì)胞和原代人成纖維細(xì)胞的LP(a)的內(nèi)化[14]。上調(diào)HepG2細(xì)胞的LDL受體的表達(dá)可以明顯增加LP(a)的內(nèi)化，而給予LDL受體單克隆抗體治療則可顯著降低LP(a)的內(nèi)化。LDL受體在LP(a)的分解代謝中起作用，而PCSK9則對(duì)這一過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)[14]。GWAS研究(全基因組關(guān)聯(lián)研究)發(fā)現(xiàn)LP(a)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與CAVD的發(fā)生存在相關(guān)性[15]?；谝陨侠碚?，具有降低LP(a)的藥物治療有望成為未來(lái)CAVD藥物治療的基礎(chǔ)。值得關(guān)注的是PCSK9單克隆抗體除顯著降低LDL膽固醇外，還可以降低LP(a)20%～40%[16]。

血脂與主動(dòng)脈瓣鈣化之間的相關(guān)性以及主動(dòng)脈瓣鈣化病變?cè)缙谂c動(dòng)脈粥樣硬化之間的相似處導(dǎo)致以下假設(shè)：他汀有可能像改善動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)后一樣使主動(dòng)脈瓣鈣化患者獲益。早期的非隨機(jī)臨床試驗(yàn)和高膽固醇血癥的動(dòng)物試驗(yàn)的確支持這一理論[17,18]。然而隨后針對(duì)中重度主動(dòng)脈瓣狹窄患者的3項(xiàng)獨(dú)立的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)卻與上述理論相悖，他汀沒(méi)能改善這兩名患者的臨床情況和預(yù)后。矛盾的結(jié)果讓我們重新審視CAVD的病理生理過(guò)程。盡管脂質(zhì)沉積和炎癥可能在CAVD的發(fā)生早期起重要作用，然而后期的鈣化、礦化階段是以鈣沉積和成骨細(xì)胞形成為特點(diǎn)的循環(huán)過(guò)程。一旦疾病進(jìn)入至進(jìn)展期，降脂藥物可能無(wú)效。在CAVD的早期，發(fā)生瓣膜僵硬和造成血流梗阻之前，可能是降脂藥物潛在發(fā)揮治療作用的窗口和時(shí)機(jī)。

在與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者觀察到的結(jié)果不同是，血漿PCSK9水平與CAVD患者主動(dòng)脈瓣鈣化積分之間無(wú)相關(guān)性。PCSK9 水平增高除與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有所增高外，還與Gensini 評(píng)分有一定相關(guān)性[19,20]。本研究推測(cè)PCSK9與CAVD的嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)是因?yàn)镻CSK9水平僅僅在CAVD發(fā)生的初始階段起作用。

綜上所述，CAVD患者PCSK9水平明顯高于對(duì)照組，PCSK9與CAVD的發(fā)生存在相關(guān)性，而與主動(dòng)脈瓣鈣化積分之間無(wú)相關(guān)性。PCSK9可能通過(guò)影響血脂代謝參與CAVD的發(fā)生和發(fā)展。

[1] Osnabrugge RL,Mylotte D,Head SJ,etal.Aortic stenosis in the elderly:disease prevalence and number of candidates for transcatheter aortic valve replacement:a meta-analysis and modeling study[J].J Am Coll Cardiol，2013,62(11):1002-1012.

[2] Rajamannan NM,Evans FJ,Aikawa E,etal.Calcific aortic valve disease:not simply a degenerative process.A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group.Executive summary:calcific aortic valve disease-2011 update[J].Circulation，2011,124(16):1783-1791.

[3] Thanassoulis G,Massaro JM,Cury R,etal.Associations of long-term and early adult atherosclerosis risk factors with aortic and mitral valve calcium[J].J Am Coll Cardiol，2010,55(22):2491-2498.

[4] McKenney JM.Understanding PCSK9 and anti-PCSK9 therapies[J].J Clin Lipidol，2015,9(2):170-186.

[5] Ridker PM,Amarenco P,Brunell R,etal.Evaluating bococizu-mab,a monoclonal antibody to PCSK9,on lipid levels and clinical events in broad patient groups with and without prior cardiovascular events:Rationale and design of the studies of PCSK9 Inhibition and the reduction of vascular events (SPIRE) lipid lowering and SPIRE cardiovascular outcomes trials[J].Am Heart J，2016,178(8):135-144.

[6] Tops LF,Wood DA,Delgado V,etal.Noninvasive evaluation of the aortic root with multislice computed tomography implications for transcatheter aortic valve replacement[J].JACC Cardiovasc Imaging，2008,1(3):321-330.

[7] Agatston AS,Janowitz WR,Hildner FJ,etal.Quantification of coronary artery calcium using ultrafast computed tomography[J].J Am Coll Cardiol，1990,15(4):827-832.

[8] Mathieu P,Boulanger MC.Basic mechanisms of calcific aortic valve disease[J].Can J Cardiol，2014,30(9):982-993.

[9] Li S,Jun Li JJ.PCSK9:A key factor modulating atherosclerosis[J].J Atheroscler Thromb，2015,22(3):221-230.

[10] Ferri N,Tibolla G,Pirillo A,etal.Proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) secreted by cultured smooth muscle cells reduces macrophages LDLR levels[J].Atherosclerosis，2012,220(2):381-386.

[11] Fantus D,Awan Z,Seidah NG,etal.Aortic calcification:Novel insights from familial hypercholesterolemia and potential role for the low-density lipoprotein receptor[J].Atherosclerosis，2013,226(1):9-15.

[12] Parisi V,Leosco D,Ferro G,etal.The lipid theory in the pathogenesis of calcific aortic stenosis[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2015,25(6):519-925.

[13] Smith JG,Luk K,Schulz CA,etal.Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis[J].JAMA，2014,312(17):1764-1771.

[14] Romagnuolo R,Scipione CA,Boffa MB,etal.Lipoprotein(a) catabolism is regulated by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 through the low density lipoprotein receptor[J].J Biol Chem，2015,290(18):11649-11662.

[15] Thanassoulis G,Campbell CY,Owens DS,etal.Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis[J].N Engl J Med，2013,368(6):503-512.

[16] Desai NR,Kohli P,Giugliano RP,etal.AMG145,a monoclonal antibody against proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,significantly reduces lipoprotein(a) in hypercholesterolemic patients receiving statin therapy:an analysis from the LDL-C assessment with proprotein convertase subtilisin kexin type 9 monoclonal antibody inhibition combined with statin therapy (LAPLACE)-thrombolysis in myocardial infarction (TIMI) 57 trial[J].Circulation，2013,128(9):962-969.

[17] Moura LM,Ramos SF,Zamorano JL,etal.Rosuvastatin affecting aortic valve endothelium to slow the progression of aortic stenosis[J].J Am Coll Cardiol，2007,49(5):554-561.

[18] Weiss RM,Ohashi M,Miller JD,etal.Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice[J].Circulation，2006,114(19):2065-2069.

[19] Wang S,Cheng ZY,Zhao ZN,etal.Correlation of serum PCSK9 in CHD patients with the severity of coronary arterial lesions[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016,20(6):1135-1139.

[20] Li S,Guo YL,Zhao X,etal.Novel and traditional lipid-related biomarkers and their combinations in predicting coronary severity[J].Sci Rep，2017,7(1):360.