唐 梅 林麗慧 林 元 薛萬興 蘇紅娥
(海南西部中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,那大 571799)
卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,具有發(fā)病隱匿、病情進展迅速、病死率高和5年生存率低等特點,已成為嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤[1]。目前,仍沒有特異性的生物學指標可以用于卵巢癌的早期診斷、指導治療及預后評估。近期的研究發(fā)現(xiàn),微小核糖核酸(microRNA,miRNA)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用,其中miRNA-21和miRNA-200b與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關,可能在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因的作用[2,3]。本研究通過檢測血漿miRNA-200b及miRNA-21在上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)患者中的表達情況,分析其表達與EOC臨床病理特征間的關系,旨在為EOC的早期診斷及靶向治療提供依據(jù)。
1.1研究對象 選取2012年1月至2016年12月海南西部中心醫(yī)院收治行手術治療的上皮性卵巢癌患者162例,年齡28~79歲,平均(54.27±11.83)歲。納入標準:①符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)分類標準和WHO分級標準,且經(jīng)病理確診為上皮性卵巢癌并適合手術治療者;②術前均未接受放射治療和化療者;③能配合本次研究及病歷資料完整者。另取同期與卵巢癌患者年齡匹配的上皮性卵巢良性腫瘤患者120例(58例良性漿液性囊腺瘤、32例黏液性囊腺瘤、21例泡膜細胞瘤、9例成熟型畸胎瘤)作為良性組和正常健康女性108例作為對照組。所有研究對象均于清晨空腹抽靜脈血5 ml,離心分離血漿后保存于-80℃冰箱待檢。
1.2方法
1.2.1主要試劑和儀器 RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司,在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)。
1.2.2miRNA的提取 取300 μl血漿樣本,加入1 ml總miRNA提取液,按照血液總miRNA快速提取試劑盒(miRNeasy血漿提取試劑盒)說明書從血漿中提取總RNA。
1.2.3miRNA逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR檢測 以U6為實驗內(nèi)參,miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應體系:5 μl RNA模板,3 μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物,0.15 μl 100 mmol/L dNTPs(with dTTP),1.00 μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μl),1.50 μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液,0.19 μl RNase抑制劑(20 U/μl),4.16 μl無菌三蒸水。反應條件:16℃ 30 min,42℃ 30 min,85℃ 5 min,4℃保存,進行逆轉(zhuǎn)錄反應。以U6為實驗內(nèi)參,反應體系為20 μl:1.00 μl TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液,10.00 μl TaqMan?Universal PCR Master MixⅡ(2×)溶液,1.33 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA,7.67 μl DEPC水。擴增條件為:95℃10 min 1個循環(huán),95℃15 s、60℃ 60 s進行40個循環(huán),實驗重復3次。每個反應體系中熒光信號達到所設定的閾值的經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值,以U6為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt法計算microRNA的相對表達水平,其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。
1.2.4血清CA125檢測 使用全自動電化學發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒檢測血清CA125水平,操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。
2.1EOC患者基本分布特征 162例EOC患者年齡≥50歲的占62.3%(101/162);手術-病理分期標準:Ⅰ期23例,Ⅱ期35例,Ⅲ期84例,Ⅳ期20例;病理類型:漿液性癌116例,透明細胞癌20例,黏液性癌14例,子宮內(nèi)膜樣癌8例,混合型細胞癌3例;病理分級:高分化癌(G1)9例,中分化癌(G2)30例,低分化癌(G3)123例;淋巴結轉(zhuǎn)移狀態(tài):有淋巴結轉(zhuǎn)移70例,無淋巴結轉(zhuǎn)移92例;術后有殘余腫瘤68例,無殘余腫瘤94例。
2.2各組血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125表達水平比較 EOC組血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125表達水平均明顯高于良性組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);而良性組與對照組血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125表達水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。
2.3EOC患者血漿miRNA-200b及miRNA-21表達與臨床病理特征的關系 隨著EOC臨床分期的進展,miRNA-200b及miRNA-21表達水平逐漸升高,Ⅲ~Ⅳ期EOC患者中兩者的表達水平明顯高于Ⅰ~Ⅱ期,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。血漿miRNA-200b及miRNA-21表達水平與淋巴結轉(zhuǎn)移及CA125水平也相關(P<0.05),而與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病理類型、病理分級及術后有殘余腫瘤無關(P>0.05)。見表2。
2.4血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125對EOC的診斷價值 血漿miRNA-200b、miRNA-21、CA125及三項聯(lián)合診斷EOC的曲線下面積(AUC)及95%CI分別為0.896(0.834~0.958)、0.792(0.731~0.847)、0.908(0.841~0.973)、0.947(0.883~0.995),與對照組(AUC=0.5)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。miRNA-200b、miRNA-21及CA125診斷EOC的最佳截值分別為2.08、1.46、52.84U/ml。三項聯(lián)合診斷EOC的敏感度和特異度較好,分別為97.2%和78.3%。見圖1和表3。
GroupsnmiRNA?200b(2-ΔΔCt)miRNA?21(2-ΔΔCt)CA125(U/ml)Controlgroup1081 15±0 341 04±0 2821 53±9 45Benigngroup1201 26±0 371 18±0 3226 27±11 36EOCgroup1623 52±1 031)2)2 32±0 451)2) 78 64±30 571)2)F15 1868 42910 619P<0 001<0 001<0 001
Note:Compared with the control group,1)P<0.01;compared with the benign group,2)P<0.01.
表2EOC患者血漿miRNA-200b及miRNA-21表達與臨床病理特征的關系
Tab.2RelationshipbetweenexpressionofplasmamiRNA-200bandmiRNA-21andclinicopathologicalfeaturesinpatientswithEOC
GroupsnmiRNA?200b(2-ΔΔCt)PmiRNA?21(2-ΔΔCt)PAge(year)0 5840 627<50613 46±0 952 27±0 42≥501013 63±1 122 42±0 63Menopause0 3630 416Yes1063 34±0 852 14±0 42No563 75±1 162 53±0 68Pathologicalstaging0 0270 034Ⅰ-Ⅱstage581 96±0 641 41±0 36Ⅲ-Ⅳstage1045 18±1 273 37±0 84Pathologicaltype0 6580 742Serouscarcinoma1163 68±1 072 50±0 48Clearcellcarcinoma203 56±1 032 42±0 46Mucinousadenocarcinoma143 42±0 932 28±0 43Endometrioidcarcinoma83 38±0 872 25±0 41Mixedcellcarcinoma33 64±1 052 53±0 56Pathologicalgrading0 5170 603G193 60±1 042 44±0 46G2303 44±0 922 25±0 39G31233 58±1 022 37±0 42Residualtumorsaftertheoperation0 1420 254Yes683 18±0 742 07±0 38No943 91±1 182 68±0 71Lymphnodemetastasis0 0060 013Yes706 28±1 314 16±1 05No921 36±0 421 47±0 38CA125(U/ml)0 0150 022<50341 92±0 601 37±0 34≥501285 26±1 283 46±0 85
圖1 血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125診斷EOC的ROC曲線Fig.1 ROC curve of plasma miRNA-200b,miRNA-21 and CA125 in diagnosis of EOC
2.5多元Logistic回歸模型分析血漿miRNA-200b及miRNA-21與EOC的關系 把EOC組與對照組作為二分變量,以miRNA-200b、miRNA-21及CA125作為自變量,應用多元Logistic回歸模型對兩組數(shù)據(jù)進行分析。結果顯示,血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125水平升高是EOC發(fā)生的獨立危險因素[OR(95%CI)=2.518(1.563~3.547),OR(95%CI)=1.724(1.103~2.528),OR(95%CI)=2.316(1.347~3.419)]。見表4。
2.6EOC患者血漿miRNA-200b與miRNA-21、CA125的相關性 Pearson相關分析顯示,血漿miRNA-200b與miRNA-21呈正相關(r=0.516,P<0.01);血漿miRNA-200b與CA125呈正相關(r=0.702,P<0.01);血漿miRNA-21與CA125呈正相關(r=0.604,P<0.01)。見圖2。
表3血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125對EOC的診斷價值
Tab.3DiagnosticvalueofplasmamiRNA-200b,miRNA-21andCA125inEOC
ItemOptimumcut?offStandarderrorAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)miRNA?200b2 080 0370 896(0 834-0 958)<0 00187 580 484 283 6miRNA?211 460 0520 792(0 731-0 847)<0 00184 270 573 881 5CA12552 84U/ml0 0350 908(0 841-0 973)<0 00191 674 878 088 6miRNA?200b+CA125-0 0310 916(0 852-0 981)<0 00194 276 379 590 8miRNA?21+CA125-0 0460 841(0 778-0 893)<0 00185 775 279 380 6Threeunions-0 0280 947(0 883-0 995)<0 00197 278 382 692 7
表4多元Logistic回歸模型分析血漿miRNA-200b及miRNA-21與EOC的關系
Tab.4MultivariateLogisticregressionmodelwasusedtoanalyzerelationshipbetweenplasmamiRNA-200bandmiRNA-21andEOC
FactorβSE(β)WaldOR95%CIPmiRNA?200b0 8140 2757 3842 5181 563-3 547<0 001miRNA?210 4820 1735 1461 7241 103-2 5280 018CA1250 6730 2386 2172 3161 347-3 4190 006
圖2 miRNA-200b與miRNA-21、CA125的相關性Fig.2 Correlation between miRNA-200b and miRNA-21 and CA125
微小核糖核酸(miRNA)是一類短的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,在卵巢生理病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,其表達的缺失或過表達會顯著影響卵巢的生理功能,有望成為治療卵巢癌患者的重要靶點[4]。已有研究證實,miRNA在EOC中異常表達,與EOC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后密切相關,可作為EOC早期診斷和預后判斷的新型標記物[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn),血漿miRNA-200b及miRNA-21在多種惡性腫瘤中異常表達,且不同惡性腫瘤組織miRNA-200b及miRNA-21的表達譜不同,是診斷惡性腫瘤患者的潛在生物學指標[6,7]。然而,血漿miRNA-200b及miRNA-21能否作為EOC早期診斷的分子標志物,目前尚無定論。
本研究結果顯示,EOC組血漿miRNA-200b、miRNA-21及CA125表達水平均明顯高于良性組和對照組,而良性組與對照組無顯著差異。在EOC患者臨床病理分期中,Ⅲ~Ⅳ期患者血漿miRNA-200b及miRNA-21的表達水平明顯高于Ⅰ~Ⅱ期。說明血漿miRNA-200b、miRNA-21在EOC患者中異常表達,可能通過發(fā)揮癌基因的作用來調(diào)節(jié)EOC的發(fā)生發(fā)展過程。國外學者從多個角度研究發(fā)現(xiàn),miRNA-200b可作為一種更強的調(diào)節(jié)因子以誘導上皮細胞的分化和上皮向基質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變,進而參與EOC的發(fā)生發(fā)展[8]。Hu等[9]通過對55例晚期卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn),miRNA-200b與卵巢癌的復發(fā)及生存率有關,在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。另有研究表明,miRNA表達水平在EOC組織中明顯降低,可抑制卵巢癌細胞增殖,并抑制細胞周期相關蛋白的表達,在EOC發(fā)生中可能存在調(diào)控關系[10]。此外,進一步分析血漿miRNA-200b及miRNA-21表達與EOC臨床病理特征的關系,發(fā)現(xiàn)兩者均與淋巴結轉(zhuǎn)移有關,提示兩者在腫瘤預測方面有一定的作用,分其原因可能是存在淋巴結轉(zhuǎn)移的患者腫瘤負荷往往較大,腫瘤組織可釋放更多的具有原癌基因作用的miRNA進入血液,同時可抑制機體原有的具有抑癌作用的miRNA水平表達,進而導致機體miRNA表達水平異常升高。Zuberi等[11]研究也顯示,miRNA-200b表達水平與腫瘤的惡性進展有關,是預測EOC患者的預后及生存的可靠標記物。
應用ROC曲線分析,結果顯示血漿miRNA-200b及miRNA-21對EOC患者的診斷效能與CA125相當,其最佳截值分別為2.08、1.46,敏感度和特異度分別為87.5%和80.4%,84.2%和70.5%;三項聯(lián)合診斷EOC的敏感度和特異度較好,分別為97.2%和78.3%。相關性分析也顯示,miRNA-200b與miRNA-21、CA125之間具有良好相關性。進一步說明了三項聯(lián)合檢測有助于提高EOC早期診斷的準確性。有報道證實血漿miRNA-200b是監(jiān)測EOC的有效指標,能夠穩(wěn)定地被檢測并能評估EOC患者的預后,有望作為EOC早期診斷的新型腫瘤標志物[12]。
Xu等[13]研究也表明,血漿miR-21可能作為一種新的診斷和預后的標志物,可作為EOC治療的新靶點。本研究中,血漿miRNA-200b及miRNA-21升高是EOC發(fā)生的獨立危險因素,而年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病理類型、病理分級及術后有殘余腫瘤與miRNA-200b及miRNA-21表達水平無關。提示miRNA-200b及miRNA-21可獨立作為EOC早期診斷的分子標志物。Meng等[14]研究認為,miRNA-200b是一種腫瘤診斷、治療及檢測預后極具潛能的生物學指標。Lv等[15]研究也發(fā)現(xiàn),miRNA-21在腫瘤組織中發(fā)揮原癌基因的作用,miRNA-21異常表達是影響腫瘤患者預后的獨立危險因素。
綜上所述,盡管CA125是EOC早期診斷的標志物已有研究證實,但仍然存在一定的不足,其診斷EOC的特異度有待提高。我們初步研究表明血漿miRNA-200b及miRNA-21在EOC患者中異常表達,其對EOC的診斷效能與CA125相當,三項聯(lián)合檢測有助于提高EOC早期診斷的準確性。但本研究為單中心的臨床研究,尚需多中心協(xié)作的前瞻性研究來進一步完善和豐富EOC診療評估體系。
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