王媛媛 曹建 鄧?yán)?/p>

[摘要] 目的 研究Toll樣受體3（TLR3）在大鼠心肌梗死中的表達(dá)及作用機(jī)制。 方法 制備TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠，采用球囊結(jié)扎冠脈方法制作心肌梗死動(dòng)物模型。隨機(jī)分為野生型假手術(shù)組（n=15）、野生型心肌梗死組（n=15）、（TLR3-/-）假手術(shù)組（n=15）、（TLR3-/-）心肌梗死組（n=15）。檢測(cè)心肌組織肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白cTnI含量；通過(guò)Western blot法檢測(cè)Toll樣受體3、NF-κB表達(dá)。 結(jié)果 與野生型心肌梗死組大鼠比較，（TLR3-/-）心肌梗死組反映心肌損傷的CK-MB、cTnI減低；NF-κB表達(dá)降低；各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 TLR3基因缺失在急性心肌梗死中具有心臟保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與下調(diào)NF-κB表達(dá)，減輕心肌梗死炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] TOLL樣受體3；急性心肌梗死；核因子-κB；基因敲除

[中圖分類號(hào)] R541；R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）01-0036-03

Mechanism of Toll-like receptor 3 in acute myocardial infarction in rats

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 DENG Li1

1.Department of Cardiology，the Third Hospital of Nanchang， Nanchang 330009，China； 2.Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang， 330006，China

[Abstract] Objective To study the expression of Toll-like receptor 3（TLR3） in myocardial infarction of rats and its mechanism. Methods TLR3 gene knockout rats and wild-type rats were prepared. Animal models of myocardial infarction were created by balloon ligation of coronary arteries. The rats were randomly divided into wild-type sham surgery group （n=15）， wild-type myocardial infarction group（n=15），（TLR3-/-）sham surgery group（n=15）， and（TLR3-/-）myocardial infarction group（n=15）. The creatine kinase（CK-MB）and troponin cTnI contents in myocardial tissues were measured. Toll-like receptor 3 and NF-κB expressions were detected by Western blot method. Results Compared with the rats in the wild-type myocardial infarction group， the levels of CK-MB and cTnI which reflected myocardial injury in the（TLR3-/-） myocardial infarction group were decreased； NF-κB expression was decreased； the differences between groups were statistically significant（P<0.05）. Conclusion TLR3 gene deletion has cardioprotective effects in acute myocardial infarction. Its protective mechanism is related to the down-regulation of NF-κB expression and alleviation of inflammatory response induced by myocardial infarction.

[Key words] TOLL-like receptor 3； Acute myocardial infarction； NF-κB； Gene knockout

急性心肌梗死是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)疾病之一，研究表明，在心肌梗死后，心肌組織會(huì)分泌大量炎性因子（如白細(xì)胞介素），炎癥因子局部異常表達(dá)及不適當(dāng)堆積可激活細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞造成心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能障礙，與心室重塑密切相關(guān)[1-3]。此外還可引起心肌細(xì)胞凋亡，在調(diào)節(jié)心臟結(jié)構(gòu)和功能中起到重要作用。調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是心肌梗死后重要治療方法之一。

Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）是生物體重要的病原體模式識(shí)別信號(hào)分子，不同的TLRs識(shí)別不同的病毒、細(xì)菌、真菌或原生物。TLRs通過(guò)促使炎性因子和干擾素釋放來(lái)抵抗病原微生物感染其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，目前TLR3在急性心肌梗死中的作用機(jī)制尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備TLR3基因敲除大鼠，并制備急性心肌梗死模型，來(lái)觀察TLR3基因敲除后對(duì)急性心肌梗死大鼠的心肌保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑材料

本研究已經(jīng)通過(guò)南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，許可證號(hào)為SCXM（贛）2014-0012，TLR3基因敲除大鼠，8周齡，雌雄各半（由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供）。野生型SD大鼠（南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。兔抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（美國(guó)Sigma公司）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白cTnI檢測(cè)試劑盒（武漢亞法生物制品有限公司）、小鼠抗Akt單克隆抗體、TLR3抗體、NF-κB抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自普利萊公司。

1.2 建立動(dòng)物模型

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組，制作大鼠急性心肌梗死模型，雄性SD大鼠，術(shù)前4 h禁食水，SD大鼠稱重后以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐間距主動(dòng)脈根部2～3 mm處，結(jié)扎左前降支深部，心電圖可見(jiàn)相應(yīng)導(dǎo)聯(lián)sT段抬高，同時(shí)肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域心肌變白，局部心肌運(yùn)動(dòng)減弱提示結(jié)扎成功。假手術(shù)組僅分離左前降支，不結(jié)扎[4]。野生型假手術(shù)組（n=15），絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈但不結(jié)扎，通過(guò)尾靜脈注射生理鹽水；野生型急性心肌梗死（AMI）對(duì)照組（n=15）制作大鼠急性心肌梗死模型；（TLR3-/-）假手術(shù)組（n=15），絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左室支但不結(jié)扎，通過(guò)尾靜脈注射生理鹽水；（TLR3-/-）急性心肌梗死對(duì)照組（n=15）制作大鼠急性心肌梗死模型。

檢測(cè)生化指標(biāo)急性心肌梗死模型制作2 h后，從腹主動(dòng)脈采血5 mL，靜置30 min，按照試劑盒說(shuō)明操作，離心10 min（4℃，3000 r/min），進(jìn)行血清分離，測(cè)定血清CK-MB及cTnI的含量，cTnI檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法，CK-MB檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫發(fā)光法。

1.3 Western blot法檢測(cè)TLR3、NF-κB蛋白表達(dá)

制模結(jié)束后處死手術(shù)處理后的存活大鼠，提取按試劑盒說(shuō)明書步驟提取總蛋白，碾磨心肌組織，BCA法蛋白進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE分離樣品后轉(zhuǎn)膜，常溫下TBST封閉過(guò)夜，加入一抗后室溫下免疫沉淀1 h，再加入兔抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗2 h，顯影，定影，掃描。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組cTnI、CK-MB水平比較

與野生型急性心肌梗死組比較，（TLR3-/-）組反映心肌缺血損傷的cTnI、CK-MB含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1、2。

2.2各組心肌組織TLR3、NF-κB蛋白表達(dá)

通過(guò)Western blot 法檢測(cè)各組TLR3、NF-κB蛋白水平。與野生型假手術(shù)組比較，野生型AMI組TLR3、NF-κB蛋白表達(dá)均增高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與野生型AMI組比較，（TLR3-/-）AMI組TLR3蛋白、NF-κB蛋白表達(dá)均降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2、3。

3 討論

急性心肌梗死致死致殘率高，是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)疾病之一，缺血心肌細(xì)胞線粒體功能障礙導(dǎo)致需氧細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生一系列活性氧簇，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，線粒體內(nèi)膜通透性改變，介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、從而存活心肌細(xì)胞減少，從而導(dǎo)致急性心肌梗死患者梗死后心衰[5-9]。

Toll樣受體是內(nèi)源性免疫的一個(gè)重要分子家族，分為細(xì)胞外區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)，內(nèi)區(qū)與白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)相似的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成，能識(shí)別侵入體內(nèi)異物，不僅激活固有免疫應(yīng)答，還可以激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，啟動(dòng)下游的信號(hào)通路，通過(guò)募集中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，釋放大量的炎癥因子（如各種白介素因子）介導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生，不同的病原體入侵可激活相應(yīng)的TLR，從而誘發(fā)初始免疫反應(yīng)產(chǎn)生炎癥。TLR3由904個(gè)氨基酸組成，其相對(duì)分子量約為125 ku，研究發(fā)現(xiàn)TLR3可誘導(dǎo)血管活性氧產(chǎn)生增加，可引起血管舒張功能受損、再內(nèi)皮化減少加劇內(nèi)皮細(xì)胞功能受損[10-14]。同時(shí)TLR3還可以識(shí)別病毒、細(xì)菌和受感染細(xì)胞中的核酸成分，誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子，人類TLR3在人動(dòng)脈粥樣硬化組織起源的平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)上調(diào)，可引起許多趨化因子和炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加[15-17]。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB作為可誘導(dǎo)并普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，可對(duì)相當(dāng)多數(shù)量的基因發(fā)揮中心性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，在免疫、炎癥、細(xì)胞的生存、增殖分化和凋亡等方面起到廣泛而重要作用。通過(guò)對(duì)腫瘤壞死因子、細(xì)胞介素（IL-1，IL-，6，IL-8）等基因的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)增加炎癥反應(yīng)[18-21]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠制作急性心肌梗死模型。野生型實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)急性心肌梗死處理，與假手術(shù)組比較，cTnI、CK-MB含量增加，TLR3蛋白及NF-κB表達(dá)增加。與野生型急性心肌梗死組比較，（TLR3-/- ）急性心肌梗死組cTnI、CK-MB含量減少。TLR3蛋白減低，NF-κB表達(dá)降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示急性心肌梗死可以刺激TLR3表達(dá)，進(jìn)一步激活NF-κB，引起心肌炎癥反應(yīng)，引起心肌損傷；而在TLR3基因敲除組大鼠，TLR3蛋白表達(dá)下降，急性心肌缺血損傷后，NF-κB表達(dá)下降，cTnI、CK-MB較野生型含量減少，提示TLR3基因缺失可通過(guò)減少NF-κB表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)急性梗死心肌起到保護(hù)作用。提示 TLR3在急性心肌梗死的發(fā)展過(guò)程中起著保護(hù)作用，但其確切的機(jī)制尚未完全明確，需要進(jìn)一步明確，為治療急性心肌梗死提供新的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-09-25）