張晨，陳哲杰，甘帥，李杰，江茂源，馬美伶，何瑤

畜禽感染性疾病高發(fā)，濫用抗生素類藥物產(chǎn)生嚴(yán)重后果，面對(duì)抗生素耐藥性及畜禽產(chǎn)品中的殘留問題，農(nóng)業(yè)部已將硫酸粘桿菌素等4種飼料用抗生素列入禁用目錄。以改善現(xiàn)狀為目標(biāo)，結(jié)合當(dāng)下畜牧業(yè)市場(chǎng)現(xiàn)狀，禁止濫用抗生素，發(fā)展綠色畜牧業(yè)已經(jīng)成為不可逆轉(zhuǎn)的主流趨勢(shì)。中草藥飼料添加劑因具有促進(jìn)生長(zhǎng)、抗菌抑菌、改善肉品質(zhì)、有害殘留低等特點(diǎn)，符合綠色畜牧業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，受到生產(chǎn)廠家和研發(fā)機(jī)構(gòu)的重視。中草藥防治抗病毒常以“清熱解毒、扶正祛邪”為治療原則，以清熱解毒類中草藥配伍具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的中藥。中獸醫(yī)師經(jīng)長(zhǎng)期臨床總結(jié)了芪藍(lán)口服液處方，芪藍(lán)口服液由黃芪、板藍(lán)根兩味中藥組成，藥理研究表明黃芪、板藍(lán)根具有調(diào)節(jié)免疫力、抗炎、抗病毒等[1～2]作用，臨床研究證實(shí)黃芪與板藍(lán)根配伍在體外對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒有很好抑制作用[3～4]。目前該方臨床應(yīng)用多為煎煮成湯劑使用，具有制備工藝混亂，質(zhì)量穩(wěn)定性差，安全性與有效性難以保障的缺點(diǎn)。

為提高芪藍(lán)口服液提取工藝的科學(xué)性與合理性，保證藥物質(zhì)量穩(wěn)定性，提高臨床療效，本研究采用原水提工藝，擬對(duì)水提工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)選取《中國(guó)獸藥典》2015版對(duì)黃芪、板藍(lán)根規(guī)定的黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春三個(gè)指標(biāo)成分的含量，同時(shí)考慮提取液的干膏收率，作為綜合評(píng)分指標(biāo)，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理結(jié)合響應(yīng)面分析法對(duì)中獸藥芪藍(lán)口服液的水提工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而保證芪藍(lán)口服液提取工藝的科學(xué)性與合理性，為芪藍(lán)口服液的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：160329）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：160329）、（R, S）告依春對(duì)照品（批號(hào)：160422），均購于成都普斯生物科技有限公司。甲醇和乙腈為色譜純（美國(guó)，Sigma-Aldrich公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。黃芪飲片（批號(hào)：1501003）；板藍(lán)根飲片（批號(hào)：1503003），均購于新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)獸藥典》2015版標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀（美國(guó)，安捷倫公司）；C18色譜柱（Global公司，4.6 mm ×250 mm×5 μm）；METTLER電子分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海耀特儀器股份有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

2.1.1 “芪藍(lán)”水提樣品的制備 稱取黃芪飲片70 g，板藍(lán)根飲片30 g，平行稱取需求份數(shù)，依試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案規(guī)定，分別加水（補(bǔ)加飲片吸水量），煎煮，合并煎煮液并濾過，以旋蒸儀濃縮至250 mL，即得水提樣品，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品液10 mL置于20mL容量瓶中，加入甲醇定容，將定容后的溶液超聲處理30 min，再移取5 mL，以12000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配成每1 mL含黃芪甲苷0.514 mg的準(zhǔn)備液；分別取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品和（R, S）告依春對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容，配成每1 mL含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.497 mg，含（R, S）告依春0.101 mg的準(zhǔn)備液。

2.2 色譜條件

2.2.1 黃芪甲苷 進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫:25 ℃；乙腈-0.1%磷酸水（33∶67）洗脫，流速為1.0 mL/min[5]。

2.2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、(R, S)告依春 進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：A：0.1%磷酸水，B：乙腈；流速：1 mL/min，洗脫梯度：0～20 min，9%乙腈；20～22 min，9%～20%乙腈；22～55 min，20%～40%乙腈[6]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.25、0.5、1、2、4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；混合對(duì)照品溶液0.25、0.5、1、2、4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。分別將兩種不同濃度的對(duì)照品溶液按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件由低到高分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

表1 三種指標(biāo)成分的線性關(guān)系

2.3.2 精密度試驗(yàn) 分別按照“2.2.1”、“2.2.2”項(xiàng)下要求，每次取同一混合對(duì)照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的RSD分別為 2.76% 、1.92%、1.45%。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一“芪藍(lán)”水提樣品按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法平行制備6份， 相同六份供試品溶液分別按照“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下要求分別測(cè)定峰面積。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的RSD分別為2.29%、1.90%、1.42%。

2.3.4 加樣回收試驗(yàn) 精密量取欲測(cè)成分含量已知的“芪藍(lán)”水提樣品溶液5 mL，平行量取6份，3份加入“2.1.3”項(xiàng)下的黃芪甲苷對(duì)照品溶液適量，3份加入“2.1.3”項(xiàng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷和（R, S）告依春的混合對(duì)照品溶液適量，全部照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備，并分別按照“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下要求分別測(cè)定峰面積測(cè)定并計(jì)算回收率。黃芪甲苷的平均回收率為101.29%，RSD值為2.48%；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為99.98%，RSD值為1.22%；（R, S）告依春的平均回收率為99.92%，RSD值為1.58%。

2.4 樣品指標(biāo)成分含量測(cè)定

取按“2.1.2”項(xiàng)下規(guī)定制得的待測(cè)樣品溶液適量加入進(jìn)樣瓶，分別將儀器設(shè)定為“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件進(jìn)行指標(biāo)成分峰面積測(cè)定，并分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算指標(biāo)成分含量。

2.5 干膏率測(cè)定

精密量取各試驗(yàn)組的水提樣品液50 mL，分別置于干燥至恒定重量的蒸發(fā)皿中，于水浴鍋上105 ℃水浴蒸干至恒定重量，置干燥器中冷卻至室溫，后迅速精密稱取重量，并計(jì)算干膏收率。

2.6 單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法試驗(yàn)中芪藍(lán)口服液水提參數(shù)的綜合評(píng)分方法

綜合評(píng)分（Y）滿分為100分，根據(jù)方中用藥量及君臣關(guān)系，劃分黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春、及干膏收率的權(quán)重分別為30、30、25、15。在此基礎(chǔ)上得到加權(quán)綜合評(píng)分公式：Y=Y1/Y1Max×30+Y2/Y2Max×30+Y3/Y3Max×25+Y4/Y4Max×15，其中Y1為每個(gè)試驗(yàn)樣品重復(fù)取樣3次測(cè)得黃芪甲苷質(zhì)量濃度和的平均值，Y1Max為樣品中黃芪甲苷質(zhì)量濃度的最大值；Y2是每個(gè)試驗(yàn)樣品重復(fù)取樣3次測(cè)得的毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度平均值，Y2Max為樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度的最大值；Y3為每個(gè)試驗(yàn)樣品重復(fù)取樣3次測(cè)得的（R, S）告依春質(zhì)量濃度平均值，Y3Max為樣品中（R, S）告依春質(zhì)量濃度的最大值；Y4為每個(gè)試驗(yàn)樣品重復(fù)取樣3次測(cè)得的干膏率，Y4Max為樣品中干膏率最大值。

2.7 水提工藝的單因素試驗(yàn)及結(jié)果

2.7.1 單因素試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)，在其他提取條件不變的情況下，分別考察提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的含量及干膏收率對(duì)綜合評(píng)分的影響。

表2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平

2.7.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響 單因素試驗(yàn)分別考察了煎煮0.5、1、1.5、2、2.5、3 h對(duì)指標(biāo)成分及干膏收率的影響，結(jié)果（見圖1）表明，按照“綜合評(píng)分方法”隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合評(píng)分逐漸升高，0.5～1.5 h最為明顯，其后趨于平穩(wěn)，為兼顧提取效果與能源節(jié)約，本試驗(yàn)將提取時(shí)間控制在1.5～2.5 h內(nèi)。

提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響 單因素試驗(yàn)分別考察了提取1、2、3、4、5次對(duì)指標(biāo)成分及藥效作用的影響，結(jié)果（見圖1）表明，按照“綜合評(píng)分方法”隨著提取次數(shù)的增加，獲得的綜合評(píng)分逐漸升高，提取1～3次綜合評(píng)分上升明顯，3次以后評(píng)分提高不明顯?？紤]到節(jié)約能源與縮短提取時(shí)間，最后確定提取次數(shù)控制在1～3次范圍內(nèi)。

料液比對(duì)綜合評(píng)分的影響 單因素試驗(yàn)分別考察了料液比為1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12對(duì)指標(biāo)成分及藥效作用的影響，結(jié)果（見圖1）表明，按照“綜合評(píng)分辦法”隨著加水量的增加，獲得的綜合評(píng)分逐漸升高，料液比為1:7～1:9時(shí)評(píng)分上升明顯，料液比大于1:9以后評(píng)分變化趨于穩(wěn)定。綜合考慮后確定料液比應(yīng)控制在1:9～1:11范圍內(nèi)。

圖1 煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、料液比多芪藍(lán)口服液提取工藝評(píng)分的影響

2.8 水取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果分析

2.8.1 響應(yīng)面法試驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間（A）1.5、2、2.5 h；提取次數(shù)（B）1、2、3次；料液比（C）1:9、1:10、1:11作為考察對(duì)象，以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的含量及干膏收率的綜合評(píng)分為響應(yīng)值，采用Design Expert8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究其對(duì)芪藍(lán)口服液提取的影響，以得到芪藍(lán)口服液的最佳水提工藝。本試驗(yàn)采用3因素3水平的響應(yīng)面法試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)見表4，響應(yīng)面法試驗(yàn)方案及結(jié)果見表5。2.8.2 數(shù)學(xué)回歸分析 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0.6對(duì)表5中各試驗(yàn)組綜合評(píng)分進(jìn)行多元回歸擬合，得綜合評(píng)分對(duì)自變量A、B、C的二次多元回歸方程為Y=90.85+1.66A+12.04B+0.20C-2.02AB-0.32AC-0.33BC-0.69A2-3.43B2-1.35C2，所建立的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性（P＜0.0001），模型決定系數(shù)R2= 0.9819，表明模型擬合度良好，方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表6。

表4 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)因素水平

表5 響應(yīng)面法試驗(yàn)方案及結(jié)果

表6 數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)擬合模型繪制不同影響因素對(duì)綜合評(píng)分的三維曲線圖與等高線圖，（見圖2、3）。由圖2、3結(jié)合表6中A、B、C三個(gè)因素的F值大小可得三個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響大小為B＞A＞C。提示，在本試驗(yàn)各因素的考察范圍內(nèi)優(yōu)選提取工藝，因素A與因素B對(duì)評(píng)分影響較大，應(yīng)首先考慮提高因素B（提取次數(shù)）的水平，其次是提高因素A（提取時(shí)間）的水平，而因素C(料液比)對(duì)綜合評(píng)分影響最小，料液比應(yīng)適當(dāng)控制，以避免實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)提取液的濃縮環(huán)節(jié)耗費(fèi)更多能源，增加生產(chǎn)成本。

圖2 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的三維效應(yīng)面圖

圖3 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的等高線圖

在響應(yīng)面模型的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)提取工藝參數(shù)的二次回歸方程求解，得水提工藝：提取時(shí)間（A）為1.5 h，提取次數(shù)（B）為3次，料液比（C）為1∶9.84。參考擬合模型數(shù)學(xué)回歸分析中三個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分影響的分析結(jié)果，為節(jié)約實(shí)際生產(chǎn)成本與實(shí)際操作方便將二次回歸方程求解工藝參數(shù)加以修正，得最優(yōu)工藝：提取時(shí)間（A）為1.5 h，提取次數(shù)（B）為3次，料液比（C）為1∶9。

2.9 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按照處方量稱取藥材，平行稱取5份，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)所得的最佳水提工藝進(jìn)行藥材的提取，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表7。試驗(yàn)結(jié)果與模擬值基本接近，各試驗(yàn)組與理論值相對(duì)誤差均小于0.97%，表明模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值間擬合度良好，同時(shí)5組試驗(yàn)綜合評(píng)分的RSD值為0.62%，表明所采取水提工藝具有較好的穩(wěn)定性，進(jìn)一步印證了該工藝的可靠性。

表7 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究根據(jù)芪藍(lán)口服液處方的藥材比例及君臣關(guān)系分別將黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R,S）告依春及干膏收率的綜合評(píng)分權(quán)重設(shè)為30、30、25、15，使得綜合評(píng)分更加合理，能較為合理的體現(xiàn)提取工藝對(duì)藥材提取效果的影響，在此基礎(chǔ)上利用Box-Behnken響應(yīng)面法在中藥復(fù)方研究中的優(yōu)勢(shì)，初步得出水提工藝，并根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要對(duì)工藝進(jìn)一步優(yōu)化，最后確定出芪藍(lán)口服液的最佳提取工藝為：取處方量藥材，提取3次，每次加9倍量水，一次1.5小時(shí)。所得最佳工藝簡(jiǎn)便可行、結(jié)果穩(wěn)定。

目前，對(duì)黃芪、板藍(lán)根及其復(fù)方的提取工藝研究中，正交試驗(yàn)是采用較多的方法。本文采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化中獸藥芪藍(lán)口服液的水提工藝，避免了正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)等方法的不足，使試驗(yàn)所得的最佳水提工藝更具科學(xué)性，為芪藍(lán)口服液的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。