眭 陽，王 瀅，于 文，王瑩超，尹 娟

(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院：1.檢驗科；2.感染管理科，江蘇蘇州 215008)

燒傷是一種常見的外科創(chuàng)傷，其能破壞皮膚的屏障功能并導致患者體內水分、電解質、蛋白質的丟失，且燒傷創(chuàng)面為開放創(chuàng)面,容易發(fā)生污染和細菌定植，導致膿毒癥的發(fā)生，甚至導致死亡[1-2]。研究表明，細菌感染是燒傷患者最嚴重的并發(fā)癥之一[3-4]。但隨著抗菌藥物的廣泛應用，各種耐藥菌株也在不斷增加，尤其是亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌的出現，給臨床上治療帶來了較大的難度，而研究探討細菌耐藥的機制并尋找有效的治療方法對于提高患者的預后具有重要的意義。為了進一步探討分析燒傷患者亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥情況和耐藥基因，本研究對本院燒傷科收集的31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌進行了藥敏試驗和聚合酶鏈反應(PCR)檢測，旨在為臨床上提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2017年2月在本院治療的燒傷患者31例，收集其臨床標本中分離出的亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌31株(剔除同一患者同一部位標本中獲得的重復菌株)，其中男22例，女9例；年齡2～70歲，中位年齡46歲；標本來源：創(chuàng)面13例，導管1例，呼吸道15例，血液1例，中段尿1例。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗 采用紙片擴散法(K-B法)進行藥敏檢測，哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和氨曲南抗菌藥物紙片均為Oxoid公司產品，具體檢測步驟按照說明書進行操作。

1.2.2PCR檢測 將菌株置于LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，取約2 g培養(yǎng)物利用DNA提取試劑盒提取DNA，在聚合酶的作用下進行擴增，擴增條件如下：94 ℃、5 min后以94 ℃、30 s進行變性，55 ℃、60 s進行退火，72 ℃、1 min后延伸2 min，此為1個循環(huán)，共進行30個循環(huán)，取PCR擴增后的產物電泳后用凝膠成像系統觀察結果并照相，以雙蒸水為陰性對照，出現目的基因色帶即為陽性。

1.2.3氰氯苯腙對主動外排系統的檢測 采用倍比稀釋法制成含不同濃度亞胺培南的M-H瓊脂平皿，將待測菌落分別接種于含氰氯苯腙(濃度為5 mg/L)的瓊脂平皿和普通瓊脂平皿上，再將平皿均置于35 ℃孵箱中培養(yǎng)16～18 h。各取兩種平皿上生長的銅綠假單胞菌落制成0.5麥氏濃度菌液，均勻涂布在已配制好的含不同濃度亞胺培南的平皿表面，最后再置35 ℃恒溫箱培養(yǎng)20 h，觀察氰氯苯腙對亞胺培南的最小抑菌濃度(MIC)的逆轉作用。若發(fā)現從含氰氯苯腙瓊脂平皿挑取的菌落的亞胺培南MIC值降至普通瓊脂上菌落MIC值的1/4以下時，則表示此菌株存在主動外排系統。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0進行數據處理和分析。計數資料采用百分數表示。

2 結 果

2.1藥敏試驗結果 亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌對慶大霉素、頭孢哌酮、頭孢吡肟、氨曲南耐藥率較高，耐藥率均大于60.00%，見表1。

表1 31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌藥敏結果[n(%)]

2.2耐藥基因檢測 31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌中，IMP基因陽性6株，陽性率為19.35%；VIM基因陽性3株，陽性率為9.68%；OprD2基因缺失5株，陽性率為16.13%；OXA-10和GES耐藥基因未檢測到。

2.3主動外排系統檢測結果 在31株細菌中，氰氯苯腙的存在使亞胺培南的MIC值下降1/4的有5株，占16.13%，其余26株無變化，提示有16.13%的菌株存在主動外排的耐藥機制。

3 討 論

燒傷一般是指由熱力(包括熱液、蒸汽、高溫氣體、火焰、電能、化學物質、放射線，灼熱金屬液體或固體等)所引起的組織損害，主要是指皮膚或黏膜的損害，嚴重者也可傷及其他組織[5-7]。深度燒傷能破壞皮膚的屏障功能，導致體內水分、電解質、蛋白質的丟失，而微生物也可經燒傷創(chuàng)面侵入引起局部或全身感染，嚴重影響患者的生活質量[8]。細菌感染是燒傷患者的嚴重并發(fā)癥之一，患者的皮膚屏障被破壞，且燒傷創(chuàng)面為開放創(chuàng)面，極易發(fā)生污染和細菌定植[9-10]。雖然新型抗菌藥物不斷被研發(fā)并使用于臨床，但細菌也在升級自己的耐藥系統與之抗衡，因此及時監(jiān)測細菌耐藥性及其變化趨勢，對于抗菌藥物的合理應用有著積極意義。

銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，也是燒傷科感染常見的致病菌，其對多種抗菌藥物均具有天然耐藥和多重耐藥，給臨床上治療帶來了較大的難度[11-12]。碳青霉烯類抗菌藥物是一類新型的β-內酰胺類抗菌藥物，具有抗菌活性強、對酶穩(wěn)定性高、不良反應少的優(yōu)點，常被用于控制燒傷科重癥感染，尤其對多重耐藥革蘭陰性桿菌和銅綠假單胞菌感染的治療效果較好[13]。但臨床醫(yī)生對該類藥物的使用日益頻繁，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率在逐年上升，且其耐藥性強、耐藥譜廣，極易在抗菌藥物的選擇壓力下產生獲得性耐藥，且多重耐藥現象比較普遍[14]，這與本研究的結果基本一致。本研究選取本院燒傷科收集的31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌進行藥敏試驗發(fā)現，亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌對慶大霉素、頭孢哌酮、頭孢吡肟、氨曲南耐藥率較高，耐藥率均大于60.00%，提示亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌對大部分抗菌藥物耐藥率較高，這無疑給臨床上治療帶來了極大的難度，而研究探討亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥的機制對于提高燒傷患者的治療效果具有重要的意義。

目前針對銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制的研究較多，發(fā)現其耐藥機制較為復雜多樣，可能與外膜孔道蛋白OprD2的缺失、主動外排系統、金屬酶產生、青霉素結合蛋白改變和生物膜形成等有關，且可能單獨存在或是協同存在[15]。OprD2蛋白是一種微孔蛋白，也是亞胺培南進入菌體內的特異性通道，編碼基因OprD2的突變可能會使OprD2蛋白的表達減少甚至缺失，導致菌體外膜蛋白對亞胺培南的通透性降低，最終引起銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥。金屬β-內酰胺酶能夠水解包括碳青酶烯類抗菌藥物在內的幾乎所有β-內酰胺類抗菌藥物，且耐藥基因能夠在菌種間轉移和傳播，從而給臨床的抗感染治療帶來了嚴重的威脅。本研究通過PCR檢測銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥相關基因及外膜蛋白基因OprD2發(fā)現，31株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌中IMP基因陽性6株，VIM基因陽性3株，OprD2基因缺失5株，而OXA-10和GES耐藥基因未檢測到，提示其耐藥機制可能與細菌膜微孔蛋白基因OprD2缺失和細菌產IMP型金屬-內酰胺酶等有關。

主動外排主要是指細菌通過外排泵把進入菌體內的抗菌藥物排出體外，這也是銅綠假單胞菌多重耐藥的一個重要原因。本研究同時發(fā)現，在31株細菌中，氰氯苯腙的存在使亞胺培南的MIC值下降1/4的有5株，提示有部分亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌菌株存在主動外排的耐藥機制。但本研究限于研究樣本的不足，對于燒傷患者亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥機制的分析仍需作進一步的深入研究。

綜上所述，亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌對大部分抗菌藥物耐藥率較高，其耐藥機制與細菌膜微孔蛋白基因OprD2缺失、細菌產IMP型金屬-內酰胺酶及細胞主動外排機制有關；臨床上應加強細菌耐藥的監(jiān)測以及抗菌藥物的合理應用，減少耐藥菌株的產生。

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