張應(yīng)龍，左汶奇

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院耳鼻喉科，重慶 402160)

電磁輻射是繼空氣、水、食品污染后的第4大污染物。隨著社會的進步，電子產(chǎn)品的使用大量增加，如微波爐、電腦、電磁爐等，人們暴露于電磁場的概率也隨之增高。手機是現(xiàn)代社會交流傳遞信息必不可少的工具，人們常常隨身攜帶。900、1 800 MHz是常用的兩種手機頻率，手機的輻射強度在每個國家有不同的規(guī)定，比如歐洲和美國標(biāo)準(zhǔn)是小于1.6 w/kg，但4 w/kg常被用來了解手機輻射的熱效應(yīng)[1]。關(guān)于手機對人體的影響，目前有學(xué)者發(fā)現(xiàn)手機電磁輻射可以導(dǎo)致精子活力的下降、神經(jīng)元細胞的數(shù)量及活力的降低，同時手機電磁輻射與神經(jīng)膠質(zhì)瘤和聽神經(jīng)瘤發(fā)病有相關(guān)性[2-4]。但有研究發(fā)現(xiàn)電磁輻射并不會引起明顯的生物學(xué)效應(yīng)，原因為電磁輻射不同于電離輻射，其能量低于電離輻射，電磁輻射對各器官的影響仍是目前研究的熱點[5]。雙耳是手機輻射的直接效應(yīng)器官，有研究發(fā)現(xiàn)幼鼠暴露于900 MHz手機電磁輻射裝置下，盡管聽力沒有改變，但耳蝸超微結(jié)構(gòu)有改變[6]；有離體研究發(fā)現(xiàn)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞在經(jīng)過脂多糖處理后暴露于1 800 MHz、4 w/kg強度下，細胞有自噬小體生成，自噬蛋白LC3-Ⅱ和beclin1有陽性表達，證實細胞超微結(jié)構(gòu)有改變[7]；還有研究報道小鼠耳蝸毛細胞HEI-OC1暴露于1 760 MHz電磁輻射系統(tǒng)下，細胞周期、蛋白表達及DNA等均未見明顯異常[8]?；钚匝醮?ROS)系統(tǒng)的激活被認為是電磁輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要機制[9]，而耳蝸邊緣細胞對維持內(nèi)耳生理具有重要作用。因此，本課題組選擇耳蝸邊緣細胞作為模擬電磁輻射研究的效應(yīng)細胞，探討1 800 MHz輻射頻率、輻射強度比吸收率(SAR)在2、4 w/kg模式下，邊緣細胞DAN的損傷、細胞凋亡情況及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料來源 0～3 d SD大鼠的乳鼠(由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)，體質(zhì)量約為5 g，雌雄不限。所有動物均按照標(biāo)準(zhǔn)化流程飼養(yǎng)，并得到重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2邊緣細胞原代培養(yǎng)及鑒定 SD大鼠乳鼠通過乙醚麻醉后，75%乙醇的容器浸泡10 min，充分消毒斷頭；在解剖顯微鏡下用顯微鑷去除顳骨聽泡骨殼后，用顯微鑷分離出耳蝸外側(cè)壁的基底回，將血管紋組織完全剝離，0.1%Ⅱ型膠原酶溶解，置于37 ℃孵箱中30 min；取出后離心，棄上清液，用1 mL MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液與之輕輕吹打混勻后，將細胞懸液置入無菌6孔培養(yǎng)板，細胞在37 ℃、95%O2、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后可貼壁，倒置顯微鏡下可以觀察到邊緣細胞的典型形態(tài)。由于成纖維細胞貼壁較慢，隔天可用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗培養(yǎng)板底部能純化邊緣細胞。將純化后細胞懸液接種于盛有用多聚賴氨酸包被后的蓋玻片無菌6孔板，當(dāng)細胞單層生長至蓋玻片的80%時，用免疫熒光染色方法檢測細胞角蛋白18(CK18)在該細胞中的表達。棄培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100穿透，5% 牛血清清蛋白(BSA)封閉，100 μL一抗(1∶50 稀釋)4 ℃孵育過夜；加入100 μL二抗(1∶100)，避光，孵箱中孵育30 min；DAPI工作液染色，抗熒光淬滅劑封片。

1.31 800 MHz輻射系統(tǒng) 該系統(tǒng)由4部分組成：高頻電磁發(fā)生器和頻帶放大器(購自北京博倫銳科技公司)、計算機、放置于培養(yǎng)箱內(nèi)的兩個矩形電磁波導(dǎo)臺(放置35 mm細胞培養(yǎng)皿)。暴露程序所有數(shù)據(jù)均由計算機控制。可以隨機設(shè)置一個波導(dǎo)臺為暴露組，另一個波導(dǎo)臺自動成為屏蔽組；也可以手動設(shè)置暴露組。

1.4細胞暴露程序及分組 細胞暴露于1 800 MHz輻射系統(tǒng)下，SAR值選擇2、4 w/kg，時間是24 h，模式是開5 min，關(guān)10 min的手機通話模式。細胞分組：(1)對照組；(2)2 w/kg暴露組和屏蔽組；(3)4 w/kg暴露組和屏蔽組；(4)雙氧水陽性對照組。

1.5彗星實驗檢測細胞DNA損傷 彗星實驗是公認的檢測單個細胞核損傷的技術(shù)，具有較高的特異度和靈敏度[10]，具體方法是棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，胰酶消化，離心棄上清液。PBS重懸，細胞計數(shù)105/mL。彗星試劑盒(購自美國Trebigen公司)，低熔點瓊脂糖100 ℃融化后60 ℃水浴箱中備用。吸取10 μL細胞懸液加入60 μL瓊脂糖中反復(fù)吹打混勻，吸取含細胞懸液的瓊脂糖10 μL鋪板后在暗盒內(nèi)4 ℃冷卻30 min待膠凝固。將載玻片放置于4 ℃裂解液中裂解2 h，避光。將載玻片放置于電泳槽中，設(shè)置電壓25 V/300 mA，時間30 min。載玻片取出后蒸餾水清洗，75%、95%無水乙醇中分別脫水。載玻片4 ℃中干燥30 min。SYBR?Green 染色15 min。熒光顯微鏡拍照。CASP軟件分析。正常細胞無拖尾現(xiàn)象，而受損細胞的DNA表現(xiàn)為像彗星一樣的拖尾，細胞的頭部基本維持在原來的位置，尾部是損傷后從細胞核遷移的DNA片段，觀察DNA損傷的3個參數(shù)：尾部DNA水平、尾力距和尾長。

1.6流式細胞技術(shù)檢測電磁輻射對邊緣細胞凋亡水平的影響 將各組細胞分別重懸于200 μL 1×結(jié)合緩沖液中，控制細胞濃度在106～107個/毫升，并分別移入流式管中；每管加入5 μL的annexin V-FITC和10 μL的PI；避光，冰上孵育15 min；流式細胞儀上讀取每組10 000個細胞的凋亡率，計算出平均值。

1.7熒光酶標(biāo)儀檢測ROS的生成 以雙氧水為陽性對照。按照1∶1 000用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA終濃度10 μmol/L。收集細胞后裝載探針。去除細胞培養(yǎng)液加入50 μL稀釋好DCFH-DA，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 min，以無血清培養(yǎng)基洗滌3次，每次5 min；收集細胞，在熒光酶標(biāo)儀中觀察細胞熒光值。激發(fā)波長使用488 nm，發(fā)射波長使用525 nm。

2 結(jié) 果

2.1邊緣細胞原代培養(yǎng)及鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的大鼠邊緣細胞。未純化前的邊緣細胞與長梭形的成纖維細胞一起貼壁生長，邊緣細胞大小不一，呈多角形，細胞間境界清楚，顏色較暗。數(shù)個細胞生長融合成單層時即呈典型的“鋪路石”特征。當(dāng)細胞堆積成多層時可形成“dome”結(jié)構(gòu)。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測邊緣細胞內(nèi)CK-18的表達，可見CK-18在邊緣細胞的細胞質(zhì)內(nèi)高表達，呈綠色熒光。

2.2彗星實驗 隨機選擇200個細胞作為結(jié)果分析，細胞拍攝時一般選擇200倍。分析軟件采用CASP Lab。雙氧水作為陽性對照，細胞有明顯的拖尾現(xiàn)象，結(jié)果顯示手機電磁輻射能量不足以引起邊緣細胞DNA的損傷。DNA損傷的3個參數(shù)與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3流式細胞技術(shù)檢測電磁輻射對邊緣細胞凋亡的影響 流式細胞檢測結(jié)果顯示雙氧水陽性對照組邊緣細胞凋亡率與對照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各組同對照組邊緣細胞相比，凋亡細胞無明顯變化(P>0.05)，說明電磁輻射不會引起邊緣細胞凋亡率增加。見表2。

2.4電磁輻射對細胞ROS生成的影響 本實驗采用DCFH-DA試劑盒檢測暴露于電磁輻射后細胞內(nèi)ROS變化情況，以雙氧水作為陽性對照。發(fā)現(xiàn)在4 w/kg輻射后ROS生成量和對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。說明4 w/kg輻射強度下ROS生成量顯著增加。

表1 各組彗星實驗參數(shù)數(shù)值

表2 細胞凋亡率和ROS生成量在各組中的表達情況

注：與對照組比較，*P<0.05

3 討 論

離體和活體研究中已經(jīng)證實ROS的激活是手機電磁輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要機制，過量產(chǎn)生的活性氧可以引起細胞不同程度的氧化應(yīng)激損傷[11]。耳蝸是保持著較高有氧代謝的器官，在產(chǎn)生ATP供應(yīng)能量的同時也能產(chǎn)生出大量ROS，因此極易遭到ROS的氧化攻擊。維持穩(wěn)定的耳蝸微電位對正常的聽力至關(guān)重要，而耳蝸微電位的維持則主要取決于耳蝸外側(cè)壁組織的泵機制。血管紋是位于耳蝸外側(cè)壁的重要組織結(jié)構(gòu)，它是由3類細胞構(gòu)成的特殊的含毛細血管的復(fù)層上皮，最外層是邊緣細胞，中間層是中間細胞，最內(nèi)層是基底細胞。而其中的邊緣細胞鄰近內(nèi)淋巴腔，其細胞膜上具有Na+-K+-ATP酶以及Na+/K+通道，對維持內(nèi)淋巴液離子環(huán)境以及耳蝸微電位具有重要意義[12]。一旦邊緣細胞受到ROS 的損害，會影響到內(nèi)耳的能量供應(yīng)。

本研究初期僅僅采用離體的短期暴露的方式研究手機電磁輻射對耳蝸邊緣細胞的影響，但手機電磁輻射對聽力系統(tǒng)的長期影響仍需要在活體研究中進一步證實。本研究中采用的手機通話模式，即開5 min關(guān)10 min暴露模式能更好地探討手機電磁輻射的生物學(xué)效應(yīng)，更能模擬手機電磁輻射對人體的影響。手機對SAR有明確的限制規(guī)定，各個國家規(guī)定和標(biāo)準(zhǔn)有所不同，但手機在接通瞬間或者信號不足的情況下輻射強度會較平常顯著增大，4 w/kg常常被用來作為電磁輻射熱效應(yīng)的研究，因此本課題組采用的2、4 w/kg輻射強度是合理的。本研究發(fā)現(xiàn)1 800 MHz手機電磁輻射不足以引起耳蝸邊緣細胞DNA的直接損傷，因為電磁輻射的能量遠較電離輻射弱，但通過熒光探針發(fā)現(xiàn)了4 w/kg輻射強度下有ROS的激活，證實了ROS的激活是手機電磁輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要機制，但生成的過量的ROS不足以引起邊緣細胞凋亡的增加和細胞DNA的損傷，認為ROS盡管增加明顯，但尚在代償范圍之內(nèi)；連續(xù)暴露于電磁輻射下，ROS的生成量會逐漸增加，超過細胞和組織的代償能力后即會出現(xiàn)損傷。有研究認為手機輻射產(chǎn)生的過量的ROS可以引起細胞DNA損傷，Ca2+通道激活，以及熱休克蛋白表達增加，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)明顯的損傷，考慮不同組織和細胞對電磁輻射有不同的敏感性[13-14]。本課題組擬進一步通過動物模型驗證手機電磁輻射的長期累積效應(yīng)。

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