錢 紅，胡 柯，劉理靜，謝 明，武 衡，李文軍，武 斌，聶 萌

(1. 湖南醫(yī)藥學院醫(yī)學院，湖南 懷化 418000；2. 南華大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；3. 懷化市第一人民醫(yī)院老年科，湖南 懷化 418000； 4. 懷化市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 懷化 418000)

腦出血是危害人類健康的常見病、多發(fā)病，具有較高的致殘率和死亡率。星形膠質(zhì)細胞活化是腦出血后繼發(fā)性損傷的主要機制[1]。神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)為星形膠質(zhì)細胞的中間絲細胞骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細胞活化的分子標記物[2-3]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種跨膜蛋白，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用小干擾RNA(small interfering RNA , siRNA)或EGFR抑制劑染料木黃酮處理大鼠星形膠質(zhì)細胞，可降低磷酸化的信號傳導蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3(phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3,p-STAT3)水平，進而下調(diào)GFAP表達，表明EGFR在觸發(fā)星形膠質(zhì)細胞由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)中起關(guān)鍵作用[4-5]。微小RNA-7(microRNA-7, miR-7)是一種由23個核苷酸組成的miRNA，定位于第9號染色體，參與細胞增殖、分化、凋亡和自噬等生物學過程，并與腦卒中相關(guān)[6]。EGFR已經(jīng)被鑒定為miR-7的靶基因[7-9]。新近研究表明，miR-7過表達有助于減少星形膠質(zhì)細胞炎癥介質(zhì)的分泌[10]。然而，miR-7對星形膠質(zhì)細胞活化的影響尚不清楚。為此，本研究以miR-7 mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染大鼠星形膠質(zhì)細胞，分析miR-7對GFAP、EGFR、STAT3和p-STAT3表達的影響，旨在為腦損傷后神經(jīng)功能恢復提供一個新的藥效學靶點。

1 材料與方法

1.1試劑新生胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；重組的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)購自北京盛科博源生物公司；STAT3特異性抑制劑S31-201購自美國Selleck公司；LipofectamineTM2000、LipofectamineTMRNAiMAX、TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；熒光素酶報告載體pGL3、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real Time PCR Master Mix購自美國Promega公司；熒光素酶檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；RIPA裂解液購自上海生工生物工程公司；兔抗大鼠GFAP、EGFR、STAT3、p-STAT3、β-actin抗體及山羊抗兔 IgG均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞的分離與培養(yǎng)取10只出生后24 h內(nèi)的新生Wistar大鼠(SPF級，由南華大學醫(yī)學研究實驗中心動物學部提供)，消毒后固定于木板上，在麻醉狀態(tài)下斷頭取大鼠頭部，取出大腦并剝離軟腦膜，分離出大腦皮層組織。用眼科剪把大腦皮層剪成碎片，再用1.25 g·L-1的胰酶消化30 min，然后加入新生胎牛血清，以終止消化過程，以1 000 r·min-1離心5 min后，小心吸棄上層液體，并將沉淀中加入DMEM培養(yǎng)液中，再用100目不銹鋼篩網(wǎng)進行過濾，收集過濾液，往過濾液中加入適量的新生胎牛血清，從而將細胞懸液的密度調(diào)整為3×108～5×108·L-1，并將其種植于培養(yǎng)瓶中，然后把培養(yǎng)瓶置入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔3～4 d更換1次培養(yǎng)液，待細胞生長成致密單層后進行傳代，取對數(shù)生長期細胞進行體外實驗。

1.3miR-7mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染效率檢測實驗分為5組：對照組、miR-7 mimic組、miR-7 mimic control組、miR-7 inhibitor組、miR-7 inhibitor control組，對照組用培養(yǎng)液處理24 h，后4組按照操作說明用LipofectamineTM2000將40 nmol·L-1的miR-7 mimic、inhibitor或者它們的陰性對照物(negative controls)分別轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞24 h，熒光實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測各組細胞miR-7的表達水平。miR-7 mimic/inhibitor及相應(yīng)的陰性對照物由廣州銳博公司合成。

1.4熒光素酶報告基因分析采用PCR的方法從星形膠質(zhì)細胞基因組DNA中擴增目的基因EGFR 3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)序列，插入熒光素酶報告載體pGL3(pGL3-EGFR)，同時構(gòu)建其突變載體(pGL3-EGFR-m)，將上述兩種質(zhì)粒分別與miR-7 mimic或mimic control共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞(由中科院上海細胞生物所細胞中心提供)24 h，使用熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶的活性。

1.5EGFRsiRNA干擾效果檢測實驗分為3組：對照組、Scramble siRNA組和EGFR siRNA組，對照組用培養(yǎng)液處理24 h，后2組將LipofectamineTMRNAiMAX(4 μL)或 20 μmol·L-1的siRNA(5 μL)加入100 μL Opti-MEM中，靜置5 min后，將上述兩種溶液混合再靜置20 min，隨后把混合液加入星形膠質(zhì)細胞中，孵育48 h后用Western blot檢測EGFR蛋白表達水平。EGFR siRNA和scrambled siRNA由上海吉瑪公司合成。EGFR siRNA正義鏈序列為5′-CCUUAGCAGUCUUAUCUAATDT-3′，反義鏈序列為5′-dTdTGGAAUCGUCAGAAUAGAUU-3′；Scramble siRNA正義鏈序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反義鏈序列為5′-ACGUGACACGUIJCGGAGAA-3′。

1.6實驗分組與處理為了觀察miR-7對GFAP、EGFR、STAT3和p-STAT3表達的影響，取上述培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞隨機分為6組：對照組、CNTF(用于活化星形膠質(zhì)細胞)組、miR-7 mimic+CNTF組、miR-7 mimic control+CNTF組、miR-7 inhibitor+CNTF組和miR-7 inhibitor control+CNTF組，對照組、CNTF組分別予DMEM培養(yǎng)液、20 μg·L-1CNTF處理48 h，后4組按照操作說明用LipofectamineTM2000將40 nmol·L-1的miR-7 mimic、inhibitor或者它們的陰性對照物分別轉(zhuǎn)染細胞24 h，再用20 μg·L-1CNTF處理24 h。為了探討EGFR/STAT3信號通路在miR-7抑制星形膠質(zhì)細胞活化中的作用，將星形膠質(zhì)細胞隨機分為5組：對照組、CNTF組、miR-7 inhibitor+CNTF組、EGFR siRNA+miR-7 inhibitor+CNTF組和S31-201+miR-7 inhibitor+CNTF組，前3組處理同上，后2組先用EGFR siRNA(20 μmol·L-1)或S31-201(10 μmol·L-1)處理細胞24 h，再給予40 nmol·L-1的miR-7 inhibitor和20 μg·L-1CNTF處理細胞24 h。待處理完畢后，進行相關(guān)指標檢測。

1.7qRT-PCR檢測miR-7、GFAP和EGFR表達采用TRIzol試劑提取星形膠質(zhì)細胞中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Tab 1所示序列由上海生工生物工程公司合成相應(yīng)的引物。在Roach480熒光實時定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預變性10 min，95℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸2 min，總共35個循環(huán)。用ΔΔCt值法，以U6水平作為內(nèi)參照定量miR-7表達，以GAPDH水平作為內(nèi)參照定量GFAP、EGFR mRNA表達。

1.8Westernblot檢測GFAP、EGFR、STAT3、p-STAT3表達用RIPA裂解液提取星形膠質(zhì)細胞蛋白質(zhì)，BCA法進行蛋白定量，上樣、電泳并轉(zhuǎn)膜，分別加入兔抗大鼠GFAP(1 ∶500)、EGFR(1 ∶500)、STAT3(1 ∶500)、p-STAT3(1 ∶500)、β-actin(1 ∶2 500)一抗，4℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶2 500)二抗，在37℃條件下孵育1 h，ECL 顯色，暗室曝光。利用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對所有膠片進行掃描，用β-actin為內(nèi)參照定量目標蛋白表達水平。

Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.9統(tǒng)計學處理所有實驗重復5次，結(jié)果取其平均值。用Graphpad Prism 5軟件制圖并進行統(tǒng)計學分析，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析及兩兩之間比較的q檢驗。

2 結(jié)果

2.1miR-7mimic/inhibitor的轉(zhuǎn)染效率為了評價miR-7的轉(zhuǎn)染效率，分別以miR-7 mimic/inhibitor及它們的陰性對照轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞24 h。Fig 1的qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-7 mimic轉(zhuǎn)染明顯增加miR-7水平，幾乎是對照組的14倍(P<0.01)，miR-7 inhibitor轉(zhuǎn)染則明顯降低miR-7水平，約為對照組的1/4(P<0.01)，而它們的陰性對照對miR-7 表達無影響(P>0.05)，提示miR-7 mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞具有較高的效率。

Fig 1 Effects of miR-7 mimic/inhibitor transfection on miR-7 expression in astrocytes

1: Control group; 2: miR-7 mimic control group; 3: miR-7 mimic group; 4: miR-7 inhibitor control group; 5: miR-7 inhibitor group.**P<0.01vscontrol group

2.2miR-7抑制CNTF誘導的星形膠質(zhì)細胞GFAP表達GFAP是星形膠質(zhì)細胞活化的分子標記物，為了觀察miR-7對星形膠質(zhì)細胞活化的影響，用CNTF和(或)miR-7 mimic/inhibitor處理細胞后，qRT-PCR、Western blot分別檢測各組細胞GFAP mRNA、蛋白的表達情況。如Fig 2、3所示，對照組GFAP mRNA與蛋白呈低水平表達，CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達水平較對照組明顯增加(P<0.01)，說明此時星形膠質(zhì)細胞處于活化狀態(tài)，與CNTF組比較，miR-7 mimic預處理降低GFAP mRNA與蛋白表達水平(P<0.01)，miR-7 inhibitor預處理增加GFAP mRNA與蛋白表達水平(P<0.01)，而它們的陰性對照無此作用(P>0.05)。結(jié)果表明miR-7可抑制CNTF誘導的星形膠質(zhì)細胞活化。

Fig 2 Expression of GFAP mRNA in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 mimic+CNTF group; 4: miR-7 mimic control+CNTF group; 5: miR-7 inhibitor+CNTF group; 6: miR-7 inhibitor control+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group

Fig 3 Expression of GFAP protein in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 mimic+CNTF group; 4: miR-7 mimic control+CNTF group; 5: miR-7 inhibitor+CNTF group; 6: miR-7 inhibitor control+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group

2.3miR-7降低星形膠質(zhì)細胞EGFR、p-STAT3水平Fig 4熒光素酶報告基因顯示，miR-7 mimic能明顯降低野生型EGFR熒光素酶活性(P<0.01)，但對突變型無影響，進一步證實EGFR為miR-7的靶基因。本課題組前期研究表明，EGFR通過磷酸化STAT3上調(diào)GFAP表達，因此，我們接下來探討miR-7對星形膠質(zhì)細胞EGFR、STAT3、p-STAT3表達的影響。由Fig 5、6可知，CNTF組EGFR表達水平和p-STAT3/STAT3比值較對照組明顯增加(P<0.01)，與CNTF組比較，miR-7 mimic+CNTF組EGFR表達水平和p-STAT3/STAT3比值降低(P<0.01)，miR-7 inhibitor+CNTF組EGFR表達水平和p-STAT3/STAT3比值升高(P<0.01)，而它們的陰性對照對上述指標無影響(P>0.05)。

Fig 4 Comparison of luciferase activity among groups**P<0.01 vs control groupFig 5 Expression of EGFR mRNA in astrocytes among groups 1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 mimic+CNTF group; 4: miR-7 mimic control+CNTF group; 5: miR-7 inhibitor+CNTF group; 6: miR-7 inhibitor control+CNTF group. **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs CNTF group

Fig 6 EGFR protein expression and p-STAT3/STAT3 ratio in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 mimic+CNTF group; 4: miR-7 mimic control+CNTF group; 5: miR-7 inhibitor+CNTF group; 6: miR-7 inhibitor control+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group

2.4EGFRsiRNA的干擾效果Fig 7 Western blot結(jié)果表明，與對照組比較，EGFR siRNA抑制了約80%的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)源性EGFR蛋白表達，差異有顯著性(P<0.01)，但Scrambled siRNA組EGFR蛋白表達水平與對照組相比無明顯差異(P>0.05)，提示EGFR siRNA能有效干擾EGFR基因表達。

Fig 7 Expression of EGFR protein in astrocytes among groups

1: Control group; 2: Scramble siRNA group; 3: EGFR siRNA group.**P<0.01vscontrol group

2.5EGFR/STAT3信號通路參與miR-7抑制星形膠質(zhì)細胞活化為了明確EGFR/STAT3信號通路在miR-7抑制星形膠質(zhì)細胞活化中的作用，以EGFR siRNA或STAT3 抑制劑S31-201預處理星形膠質(zhì)細胞，再予miR-7 inhibitor和 CNTF孵育，qRT-PCR、Western blot檢測GFAP mRNA與蛋白表達。Fig 8、9結(jié)果顯示，miR-7 inhibitor+CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達水平較CNTF組增加(P<0.01)，EGFR siRNA或S31-201預處理后加miR-7 inhibitor和 CNTF，GFAP mRNA與蛋白表達水平明顯降低，與miR-7 inhibitor+CNTF組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，提示miR-7通過EGFR/STAT3途徑抑制CNTF誘導的星形膠質(zhì)細胞活化。

Fig 8 Expression of GFAP mRNA in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 inhibitor+CNTF group; 4: EGFR siRNA+miR-7 inhibitor+CNTF group; 5: S31-201+miR-7 inhibitor+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group;▲▲P<0.01vsmiR-7 inhibitor+CNTF group

Fig 9 Expression of GFAP protein in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 inhibitor+CNTF group; 4: EGFR siRNA+miR-7 inhibitor+CNTF group; 5: S31-201+miR-7 inhibitor+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group;▲▲P<0.01vsmiR-7 inhibitor+CNTF group

3 討論

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最為豐富的細胞，與神經(jīng)元之間存在復雜的相互作用，有助于維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在腦出血等病理情況下，星形膠質(zhì)細胞從靜息狀態(tài)快速轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，活化的星形膠質(zhì)細胞一方面能夠分泌多種細胞因子、炎癥因子和補體蛋白等，導致繼發(fā)性的神經(jīng)損傷，另一方面促進瘢痕形成，阻礙神經(jīng)再生[11]。因此，抑制星形膠質(zhì)細胞活化已成為防治腦出血后繼發(fā)性損傷的重要策略。miRNAs是一類長度為19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，導致其翻譯過程受到抑制或引起mRNA的降解，在轉(zhuǎn)錄后水平特異性影響靶基因表達[12-13]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs失調(diào)與腦出血的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為腦出血早期診斷及預后評估的重要分子標記物[14]。本研究以miR-7 mimic、inhibitor和(或)CNTF處理大鼠星形膠質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)miR-7 mimic+CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達水平較CNTF組降低，而miR-7 inhibitor+CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達水平較CNTF組升高，這些結(jié)果表明miR-7可抑制CNTF誘導的星形膠質(zhì)細胞活化。

EGFR是一種由53個氨基酸組成的活性多肽，廣泛表達于上皮、間質(zhì)及神經(jīng)組織，與其配體結(jié)合后，可磷酸化STAT3，進而促進包括GFAP在內(nèi)的多個基因轉(zhuǎn)錄[15]。研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后血腫周圍腦組織EGFR表達迅速上調(diào)，且主要定位于活化的星形膠質(zhì)細胞，并持續(xù)較長時間[16]。我們前期研究表明，EGFR siRNA通過抑制STAT3磷酸化拮抗CNTF誘導的星形膠質(zhì)細胞活化[4]。miRNAs本身不具備生物學功能，通過沉默其靶基因才能發(fā)揮作用。熒光素酶報告基因發(fā)現(xiàn)，miR-7 mimic明顯減少野生型EGFR熒光素酶活性，但對突變型無影響，表明EGFR為miR-7的靶基因，與文獻報道一致[7-9]。此外，相對于CNTF組，miR-7 mimic+CNTF組EGFR表達水平和p-STAT3/STAT3比值降低，而miR-7 inhibitor+CNTF組EGFR表達水平和p-STAT3/STAT3比值增加，提示miR-7通過靶向沉默EGFR抑制STAT3磷酸化。為了明確EGFR/ STAT3信號通路在miR-7抑制CNTF誘導的星形膠質(zhì)細胞活化中的作用，本研究以EGFR siRNA或STAT3的抑制劑S31-201預處理星形膠質(zhì)細胞，再用miR-7 inhibitor和 CNTF孵育，發(fā)現(xiàn)干擾EGFR/STAT3信號通路幾乎完全逆轉(zhuǎn)了miR-7 inhibitor對GFAP表達的促進作用，表明抑制EGFR/STAT3信號通路可能是miR-7阻滯星形膠質(zhì)細胞活化的主要機制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miR-7通過靶向沉默EGFR，使p-STAT3水平減少，從而抑制CNTF誘導的星形膠質(zhì)細胞活化。然而，miR-7在體內(nèi)是否有這種保護作用尚需進一步研究。此外，一個miRNA有多個靶基因，多個miRNAs可以作用于同一個靶基因，因此，miR-7也可能通過其它靶基因影響星形膠質(zhì)細胞活化。隨著對這些問題的深入探討，將進一步揭示miR-7在腦出血后繼發(fā)性損傷中的作用。

(致謝： 本實驗在侗醫(yī)藥研究湖南省重點實驗室和南華大學附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所完成，感謝各位老師的指導和幫助。)

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