劉艷艷，萬昶宸，孫宇鵬，張 霞，廖 曼，程曉葉，張?zhí)m桐

(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北 石家莊 050017)

間尼索地平(m-nisoldipine，MNS)[化學(xué)名稱：1, 4-二氫-2, 6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶二羧酸甲酯異丁酯]是由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院首次合成的一類新型二氫吡啶類藥物，存在一個手性中心，可拆分為兩個光學(xué)對映體(R,S-m-nisoldipine)[1]。二氫吡啶類藥物為鈣通道拮抗劑，特異性高，在臨床上廣泛用于治療高血壓。

細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的同工酶，參與代謝90%以上的藥物[2]。CYP450酶容易被多種物質(zhì)激活，其活性的高低是影響許多藥物療效及藥物間相互作用的原因之一。人孕烷X受體(human pregnane X receptor，hPXR)[3]為研究較為深入的一類核受體，是能夠調(diào)控藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在物質(zhì)代謝中起重要作用。許多藥物能夠作為hPXR配基而激活該受體，繼而識別和結(jié)合到靶基因啟動子特異的DNA序列上，上調(diào)CYP酶家族主要亞型的表達(dá)[4]。CYP450酶的表達(dá)可以被諸多外源性物質(zhì)所誘導(dǎo)，以往研究已證明這種誘導(dǎo)主要是經(jīng)核受體hPXR介導(dǎo)的。胡東莉[5]研究了硝苯地平通過hPXR受體對CYP450酶的調(diào)節(jié)機(jī)制。本文基于酶誘導(dǎo)的分子機(jī)制，通過構(gòu)建包含CYP450啟動子調(diào)控元件的熒光素酶報告基因載體，建立了藥物誘導(dǎo)劑的體外篩選體系，研究間尼索地平誘導(dǎo)作用的分子機(jī)制，可用于預(yù)測間尼索地平對映體是否具有潛在的代謝酶誘導(dǎo)作用，進(jìn)而指導(dǎo)藥物開發(fā)及其臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑R,S-MNS原料藥為本院藥物化學(xué)教研室提供，含量>99.5%；限制性內(nèi)切酶NcoI、XhoI、BglII、KpnI和連接酶EL0011購自Thermo Fermentas；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體試劑購自Life Technology；KOD-FX DNA聚合酶購于Toyobo；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清均購自Gibco公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購自O(shè)mega。

1.2儀器潔凈工作臺(蘇凈安泰)；熒光倒置顯微鏡(Olympus)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Sanyo)；JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)、JY300C電泳儀、JY-SPFT電泳槽(君意東方)；PCR擴(kuò)增儀(Bioer)；酶標(biāo)儀(BioTek Gene5)。

1.3啟動子及hPXR基因序列的獲得根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中序列號信息(GenBank ID: 1555、1559、1576、8856)設(shè)計啟動子及hPXR相應(yīng)PCR特異性引物。引物序列見Tab 1，其中CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4引物序列上游引物存在KpnI位點，下游引物存在BglIII位點，hPXR序列上游引物存在NcoI位點，下游引物存在XhoI位點。以人肝DNA為模版，分別擴(kuò)增相應(yīng)啟動子調(diào)控序列和基因片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物，在紫外燈下切取含有目的條帶的膠條，使用凝膠回收試劑盒純化回收目的DNA片段，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

Tab 1 Primer sequences of cytochrome P450s and hPXR

1.4載體的構(gòu)建雙熒光素酶表達(dá)載體和包含CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4啟動子的雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[6]。參照pGL3-basic多克隆位點以及基因區(qū)域酶切位點，在基因5’引入KpnI，在3′引入BglIII，將改造后的pGL3-basic載體分別與PCR擴(kuò)增的CYP450酶片段以KpnI和BglIII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。參照pcDNA多克隆位點以及基因區(qū)域酶切位點，在基因5’引入NcoI，在3′引入XhoI，將改造后的pcDNA表達(dá)載體與PCR擴(kuò)增的hPXR片段以NcoI和XhoI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定表達(dá)載體和報告載體質(zhì)粒中是否含有所需目的片段。將鑒定正確的克隆菌液送至金唯智生物科技有限公司測序[7]。構(gòu)建的載體測序檢測正確后命名為P1：pGL3-CYP2B6-promoter；P2：pGL3-CYP2C9-promoter；P3：pGL3-CYP3A4-promoter；PXR：pcDNA3.1-hPXR+GFP。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞用DMEM+10% FBS進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前取對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時，將100 ng pGL3-CYP2B6-promoter或pGL3-CYP2C9-promoter或pGL3-CYP3A4-promoter，100 ng pcDNA3.1-hPXR+GFP或 pcDNA3.1+GFP空載體，10 ng作為內(nèi)對照的pRL-TK，0.3 μL LipofectamineTM2000陽離子脂質(zhì)體，與50 μL轉(zhuǎn)染用Opti培養(yǎng)基混合孵育，放置5-10 min，當(dāng)DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成后，以每孔100 μL的量將DNA-lipo2000-opti復(fù)合物加入96孔板，轉(zhuǎn)染6～8 h后，棄去原培養(yǎng)基，換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，過夜后進(jìn)行藥物處理。

1.6待測藥物處理和熒光素酶活性檢測R,S-間尼索地平分別用DMSO配制, 細(xì)胞轉(zhuǎn)染8 h后，分別加入9.7、2.425、1.2125 mg·L-1的R-間尼索地平和S-間尼索地平藥物培養(yǎng)48 h，同時設(shè)置僅含0.1% DMSO的對照組。處理后的細(xì)胞用雙熒光素酶活性分析試劑盒處理，分別測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性值，設(shè)置3個復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1不同濃度R,S-間尼索地平對hPXR介導(dǎo)的CYP450酶的誘導(dǎo)作用R-間尼索地平在1.2125 mg·L-1濃度下不能通過hPXR產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，但在2.425、9.7 mg·L-1濃度下誘導(dǎo)CYP2B6表達(dá)增加2.11和2.44倍，在9.7 mg·L-1濃度下誘導(dǎo)CYP2C9表達(dá)增加2.78倍，在2.425、9.7 mg·L-1濃度下誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)增加2.56和2.89倍，與0.1% DMSO溶媒對照組差異有顯著性(P<0.05)。

S-間尼索地平在2.425、9.7 mg·L-1濃度下誘導(dǎo)CYP2B6表達(dá)增加1.56和2.67倍，在1.2125、2.425 mg·L-1濃度下誘導(dǎo)CYP2C9表達(dá)增加1.55和1.96倍，與0.1% DMSO溶媒對照組差異有顯著性(P<0.05)，但不能通過PXR對CYP3A4產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。

3 討論

人體內(nèi)CYP1A2、2B6、2C9、2D6、3A4與大部分現(xiàn)有臨床藥物的代謝相關(guān)。間尼索地平為二氫吡啶類藥物，有研究發(fā)現(xiàn)[8]，長期給與大鼠R,S-間尼索地平后，對CYP2B、2C、3A亞型有誘導(dǎo)作用。為研究該藥物對人體內(nèi)各酶亞型的影響，本文利用熒光素酶系統(tǒng)證實這種調(diào)節(jié)是由hPXR來介導(dǎo)的。

在本實驗中，R,S構(gòu)型藥物對CYP2B6的誘導(dǎo)作用可以通過hPXR介導(dǎo)，并表現(xiàn)出明確的劑量-效應(yīng)關(guān)系。R構(gòu)型藥物在高濃度下明顯誘導(dǎo)CYP2C9表達(dá)，而S構(gòu)型在低、中濃度下可以明顯誘導(dǎo)CYP2C9表達(dá)，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于R和S構(gòu)型藥物對hPXR活化程度不同，從而影響后續(xù)與CYP2C9啟動子結(jié)合。R構(gòu)型藥物對CYP3A4的誘導(dǎo)作用可以通過hPXR介導(dǎo)，并表現(xiàn)出明確的劑量-效應(yīng)關(guān)系，但S構(gòu)型藥物對CYP3A4無明顯誘導(dǎo)作用，這可能是兩個構(gòu)型的藥物結(jié)構(gòu)上的不同影響hPXR通路誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)。

本研究成功建立了CYP450酶的藥物誘導(dǎo)劑的體外篩選體系，為間尼索地平臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)，但間尼索地平的不同構(gòu)型是否與其他代謝酶底物存在著潛在的競爭性抑制，從而造成基于代謝酶的藥物相互作用而限制其臨床應(yīng)用，需要進(jìn)行更深入的研究，并成為臨床用藥必須考慮的問題。

[1] Sun Y P, Jia P P, Yuan L, et al. Investigating the in vitro stereoselective metabolism of m-nisoldipine enantiomers: characterization of metabolites and cytochrome 450 isoforms involved[J].BiomedChromatogr, 2015,12(29): 1893-900.

[2] Zanger U M, Schwab M. Cychrome P450 enzymes in drug metabolism: Regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation[J].PharmacolTher, 2013,138: 103-41.

[3] Niemira M, Dastych J, Mazerska Z. Pregnane X receptor dependent up-regulation of CYP2C9 and CYP3A4 in tumor cells by antitumor anridine agents, C-1748 and C-1305, selectively diminished under hypoxia[J].BiochemPharmacol, 2013,86:231-41.

[4] Lemaire G, Sousa G D, Rahmani R. A PXR reporter gene assay in a stable cell culture system: CYP3A4 and CYP2B6 induction by pesticides[J].BiochemPharmacol, 2004,68: 2347-58.

[5] 胡東莉. 硝苯地平對人孕烷X受體介導(dǎo)的CYP2B6和CYP2C9的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的研究[D]. 長沙：中南大學(xué), 2013.

[5] Hu D L. The transcriptional regulation effects of nifedipine on CYP2B6 and CYP2C9 activities inducible mediated by hPXR[D]. Changsha: Central South University, 2013.

[6] Chen Y P, Ferguson S S, Negishi M, et al. Induction of human CYP2C9 by rifampicin, hyperforin, and phenobarbital is mediated by the pregnane X receptor[J].JPharmacolExpTher, 2004,308: 495-501.

[7] 韋忠紅, 朱智杰, 劉玉萍, 等. TNF-α 3′-UTR雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及丹參酮類藥物篩選[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015,31(1): 77-81.

[7] Wei Z H, Zhu Z J, Liu Y P, et al. Construction of pGL3-TNF-α 3′-UTR luciferase reporter gene and tanshinone compounds screening[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(1): 77-81.

[8] 孫宇鵬. 基于細(xì)胞色素P450代謝酶的間尼索地平代謝轉(zhuǎn)化及藥物-藥物相互作用 (DDI) 研究[D]. 石家莊：河北醫(yī)科大學(xué), 2016.

[8] Sun Y P. Drug-drug interaction and metabolism of m-nisoldipine based on cytochrome P450[D]. Shijiazhuang: Hebei Medical University, 2016.