吳樹金，薩日娜，顧志榮，趙 佩，于 靜，王艷紅，葛 斌

(甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000)

肝損傷是人類最常見的疾病之一。動物肝損傷模型種類較多，與其他中毒性肝損傷如CCl4模型等相比，刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)誘發(fā)的肝損傷模型模擬了人類病毒性肝炎引發(fā)的免疫性肝損傷的病理生理過程，更適合研究人類病毒性肝炎。目前研究表明，ConA誘導肝損傷重要機制之一為其活化T淋巴細胞后，由腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor 2，TNF-R2)介導活性氧(reactive oxygen species，ROS)增多，進而誘導肝細胞c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)活性及表達增多[1-3]。Maeda等[4]證實，JNK在ConA肝損傷中起關鍵作用，在JNK1或JNK2表達缺失的小鼠中，ConA和脂多糖加半乳糖胺誘導的肝損傷被明顯抑制；更為重要的是，抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)等可以明顯抑制ConA損傷小鼠中JNK的活化并保護肝損傷，提示JNK為ROS途徑的下游作用靶點[3-5]。因此，抑制ROS及其介導的JNK的活化是肝損傷，尤其是TNF-α相關依賴性肝損傷的重要環(huán)節(jié)。

目前，治療肝損傷的藥物由于有效性缺乏、不良反應多、安全性低等原因，無法滿足臨床需求，因此，趨向于篩選出具有更好安全性和功效特征的藥物。馬栗種子提取物(Aesculushippocastanumseeds extract，AH)為歐洲七葉樹種子的提取物，主要成分為七葉素，亦是其發(fā)揮藥理作用的主要成分。AH具有較好的臨床使用安全性，主要應用于慢性靜脈功能不全、痔靜脈曲張等。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用，尤其AH在體內、體外實驗中均證實為強抗氧化劑，其清除ROS的能力為L-抗壞血酸的20倍之多[6-9]。關于AH的強抗氧化作用主要因其結構分子中含有大量羥基，具有很強的供H+和離子鰲合能力，從而起到清除ROS的作用[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，AH可有效改善大鼠腦缺血/再灌注損傷[11]；Elmas等[12]研究發(fā)現(xiàn)，AH對大鼠糖尿病腎病具有保護作用，機制與AH抑制氧化應激有關。我們前期的研究在四氯化碳誘導的肝損傷模型中，初步觀察到AH可有效降低小鼠肝臟TNF-α水平，可能具有肝損傷保護作用，但具體機制尚不清楚[13]。AH是否對ConA誘導的急性肝損傷具有保護作用，其機制是否與ROS介導的JNK途徑有關尚不清楚?；谖覀兦捌诘难芯炕A，本研究在小鼠體內實驗中，觀察AH對ConA誘導急性肝損傷的作用，同時探討其相關機制是否與AH抗氧化，進而抑制其介導的JNK途徑有關。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級昆明小鼠，♂，體質量18～22 g，由甘肅省中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

1.1.2試劑 ConA為Sigma公司產品；IFN-γ、TNF-α ELISA試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司；其余試劑均為化學分析純。

1.1.3儀器 LS-50B型熒光分光光度計(日本Shimadu公司)；IX-70型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2馬栗種子提取物混懸液的制備AH為德國威瑪舒培博士藥廠生產，生產批號：0780117。每片含馬栗種子干燥提取物263.2 mg，標定含有50 mg七葉素。將AH粉碎溶解于蒸餾水，以其中七葉素含量為標定，制備成濃度為2.5 g·L-1的混懸液，不同劑量給藥組以含七葉素量標定分別為12.5、25、50 mg·kg-1。

1.3肝損傷模型的制備[14]將96只昆明小鼠隨機分為正常組、模型組、醋酸潑尼松組(PNS)、AH低、中、高劑量保護組，每組16只。適應性飼養(yǎng)3 d后，分別給予PNS(7.8 mg·kg-1)、AH (12.5、25、50 mg·kg-1)灌胃，正常組與模型組分別灌胃等體積生理鹽水，共計20 d。末次灌胃給藥后，正常對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水10 mL·kg-1，其余各組小鼠均一次性按體質量20 mg·kg-1尾靜脈注射ConA，8 h后所有小鼠進行采血、取材后處死。本研究中動物實驗遵循的所有程序均符合國家及甘肅省人民醫(yī)院制訂的有關實驗動物的規(guī)則和制度。

1.4肝臟組織HE染色及病理學改變的評價取小鼠肝右葉條形組織塊(約0.2 g)，4%中性多聚甲醛固定、石蠟包埋、制成4 μm連續(xù)切片后，固定在玻片上，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組肝組織結構的病理變化。由3位病理科主治醫(yī)師進行雙盲讀片，并對觀察到的每張病理切片所顯示肝臟損傷程度進行分級。本實驗中，鏡下見肝臟損傷程度評分標準如下，0級：正常肝組織細胞；Ⅰ級：輕度肝細胞腫脹，散發(fā)炎性細胞，個別肝細胞壞死；Ⅱ級：少于肝小葉1/3的局灶或斑塊性肝細胞壞死，聚集炎性細胞浸潤；Ⅲ級：廣泛的肝細胞壞死，約占1/3至1/2的肝小葉，大量炎性細胞浸潤；IV級：肝細胞壞死多于肝小葉的1/2，廣泛炎性細胞浸潤[14]。

1.5血清指標檢測模型制備成功后，所有小鼠進行眼眶采血，將采集好的全血置于低速自動平衡離心機內離心，2 000 r·min-1，15 min。離心后上清采用全自動生化分析儀檢測AST、ALT、TP、Alb 及A/G比。血清IFN-γ、TNF-α采用ELISA試劑盒按說明書進行檢測。

1.6肝組織MDA、SOD、GSH檢測切取左前葉肝組織0.5 g左右，冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重，冰浴中制成10%肝勻漿，3 500 r·min-1低溫離心15 min, 取上清液。按說明書采用硫代巴比妥酸比色法檢測MDA含量，TNB法檢測GSH水平，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

1.7caspase-3活性檢測按照每3～10 mg組織加入100 μL裂解液的比例加入專用裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿，然后把勻漿液轉移到1.5 mL離心管中，冰浴再裂解5 min后， 4 ℃、16 000×g離心15 min，將上清轉移到冰浴預冷的離心管中，立即測定caspase-3的酶活性，酶標儀于405 nm處讀取相應值。

1.8Westernblot提取總蛋白后，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，并將樣品的濃度均調整為5 g·L-1，溶解在10 g·L-1十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)中，上樣體積8 μL，制作轉膜“三明治”，0.4 A恒流轉膜60 min，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。倒掉封閉液, 用5%的脫脂奶粉按一定比例稀釋一抗，將膜置于一抗孵育液中，4℃搖動過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min。用5%的脫脂奶粉按一定比例稀釋羊抗兔二抗，將膜置于二抗孵育液中，室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min，ODYSSEY Fc imaging system顯色，拍照。數(shù)據(jù)用樣品與β-actin的比值表示。

2 結果

2.1AH對ConA誘導急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、TP、Alb、A/G比的影響Tab 1結果顯示，與正常對照組相比，ConA模型組小鼠的血清ALT、AST水平明顯增高，同時血清TP、Alb、A/G比明顯降低；陽性對照藥PNS(7.8 mg·kg-1)及AH(12.5、25、50 mg·kg-1)可以濃度依賴性地抑制ConA所致小鼠血清ALT、AST水平的增高及TP、Alb、A/G比的降低(P<0.05)。

Tab 1 Protective effects of AH on serum ALT, AST, TP and Alb levels and A/G ratio in ConA-induced liver injury model (±s, n=16)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsConA

2.2AH對ConA誘導急性肝損傷小鼠肝臟病理組織學的影響Fig 1 HE染色結果顯示，正常組小鼠肝臟未見明顯異常，在染色中肝細胞胞質均勻紅染，細胞核大小正常，核質淡染，肝竇清晰可見，肝索排列整齊。ConA模型組肝組織內大量淋巴細胞浸潤，匯管區(qū)少量淋巴細胞、粒細胞存在，肝竇內大量紅細胞淤積，肝板消失、凋亡小體散在、肝細胞脂肪變性。AH及PNS組均明顯減輕肝臟炎癥壞死的程度，病理損傷分級降低(Tab 2)。

Fig 1 Histopathological analysis of protective effect of AH on ConA-induced liver injury(×400)

A: Control; B: ConA; C: ConA+12.5 mg·kg-1AH; D: ConA+25 mg·kg-1AH; E: ConA+50 mg·kg-1AH; F: ConA+PNS. Blue arrow: Normal hepatocyte; Yellow arrow: Hepatocellular necrosis

2.3AH對ConA誘導急性肝損傷小鼠血清IFN-γ、TNF-α的影響Tab 3結果顯示，與正常對照組相比，ConA模型組小鼠的血清IFN-γ、TNF-α水平明顯增高；PNS及AH (12.5、25、50 mg·kg-1)可以明顯抑制ConA所致小鼠血清IFN-γ、TNF-α水平的增高。

Tab 2 Histopathological analysis of protective effect of AH on ConA-induced liver injury(n=16)

*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs ConA

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsConA

2.4AH對ConA誘導急性肝損傷小鼠肝臟組織MDA、SOD、GSH的影響與正常對照組相比，ConA模型組小鼠肝組織MDA水平明顯增高，同時GSH、SOD水平明顯降低；PNS及AH(12.5、25、50 mg·kg-1)均可明顯抑制ConA所致小鼠肝組織MDA水平的增高及GSH、SOD的降低(Tab 4)。

2.5AH對ConA誘導急性肝損傷小鼠的肝細胞凋亡相關指標的影響如Fig 2所示，與正常對照組相比，ConA損傷組小鼠肝組織細胞色素C、caspase-3、Bax/Bcl-2比值明顯增高；PNS及AH(12.5、25、50 mg·kg-1)組細胞色素C、caspase-3、Bax/Bcl-2比值較ConA組明顯降低(P<0.05)。

Fig 2 Effect of AH on cell apoptosis-related markers in ConA-induced liver injury model (±s, n=3)

A: Expression of cytochrome C detected by Western blot; B: Caspase-3 activity; C: Bax and Bcl-2 expression.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsConA group

Tab 4 Effects of AH on MDA, SOD, GSH levels of liver tissues in ConA-induced liver injury model (±s, n=16)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsConA

2.6AH對ConA誘導急性肝損傷小鼠肝組織JNK、Akt表達的影響如Fig 3所示，與正常對照組相比，ConA模型組小鼠的肝組織p-JNK表達明顯增高，p-Akt表達明顯降低；PNS及AH(12.5、25、50 mg·kg-1)組相比ConA損傷組，p-JNK表達明顯降低，同時p-Akt明顯增高。

3 討論

本研究在小鼠體內實驗中證實AH對ConA誘導的急性肝損傷具有一定的保護作用。 AH可明顯改善ConA誘導的急性肝損傷的病理分級，降低ConA所致血清ALT、AST水平的增高，相關研究顯示其機制與AH保護抗氧化酶體系，抑制ROS產生，進而抑制JNK及其介導的線粒體細胞凋亡損傷途徑相關。

AH具有強抗氧化作用，為了探究其是否對肝損傷具有保護作用，本研究首先檢測了各組小鼠血清ALT、AST、TP、Alb 水平及A/G比值這5個主要反映肝功能的指標。結果顯示，不同濃度AH可以明顯降低ConA誘導的ALT、AST水平的增高，同時保護TP、Alb 水平及A/G比的降低。各組肝損傷的病理改變及分級情況與血清學改變結果相一致，AH可以明顯改善ConA誘導的肝臟病理學改變，同時AH可以明顯抑制ConA誘導的TNF-α、IFN-γ的釋放。上述結果提示，AH對ConA誘導的急性肝損傷具有一定的保護作用。

本研究進一步進行了相關機制研究。我們前期研究顯示，AH的抗氧化作用主要與其保護體內的抗氧化酶及抑制脂質過氧化物MDA的產生有關。正常機體內的氧化與抗氧化系統(tǒng)處于相對平衡狀態(tài)，ROS包括O2-、OH-、H2O2等，體內的抗氧化酶主要有GSH、SOD等，其中GSH在肝內含量最高，主要由肝細胞合成。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，其本身則被氧化為GSSG；而SOD可以催化O2-生成H2O2，從而減少O2-與NO的反應。另外，氧自由基能攻擊生物膜中的多元不飽和脂肪酸，形成脂質過氧化代謝終產物MDA，其含量反映體內脂質過氧化的程度。與我們以往在CCl4誘導肝損傷模型中的研究結果相一致，本研究結果顯示，AH可以明顯升高ConA誘導的GSH、SOD水平，同時降低MDA水平，這間接反映了AH可明顯抑制ConA誘導的氧化應激。

Fig 3 Effect of AH on p-JNK(A) and p-Akt(B) expression in ConA-induced liver injury model (±s, n=3)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsConA group

目前研究表明，ROS通過下游一系列信號轉導途徑誘導肝損傷，其中重要途徑之一為其介導的JNK途徑[3]。JNK活化后，在細胞周期、增殖、凋亡、細胞應激等多種生理和病理過程中起重要作用。JNK被細胞因子或ROS激活而磷酸化為p-JNK，作用于線粒體通路，通過影響B(tài)ax/Bcl-2比值導致線粒體凋亡，細胞色素C釋放增多，同時激活caspase家族級聯(lián)反應，誘導caspase-3活化，最終導致細胞凋亡[3,15]。我們的結果顯示，AH可以濃度依賴性抑制ConA所致小鼠肝組織細胞色素C水平、caspase-3活力及Bax/Bcl-2比值增高，這初步提示JNK途徑可能介導了AH對ConA誘導的肝損傷的保護作用。進而我們直接檢測各組小鼠肝組織的p-JNK蛋白表達情況，結果顯示，ConA可以明顯誘導肝組織p-JNK蛋白表達增多，而AH保護組p-JNK蛋白表達明顯被抑制；同時檢測了p-Akt蛋白表達情況。Akt信號通路被生長和存活因子激活而磷酸化，誘導Bcl-2表達的增加及Bax表達的降低，從而抑制線粒體途徑的凋亡，同時p-Akt也可以直接阻礙JNK的磷酸化，從而抑制caspase的活化，減輕細胞凋亡[16]。與p-JNK的表達相反，ConA可以明顯誘導肝組織p-Akt蛋白表達減少，而AH可以明顯升高p-Akt表達，該結果進一步證實了JNK途徑在AH保護ConA誘導的肝損傷中的作用。本研究在動物模型中未能徹底驗證AH抑制的JNK途徑是否為ROS所介導，本課題組將在體外肝細胞培養(yǎng)模型中，運用ROS抑制劑、JNK siRNA及JNK的特異性阻斷劑等，通過檢測AH+ siRNA JNK處理后相關肝損傷指標變化、抗氧化劑處理后JNK的表達變化等，進一步探討AH、ROS、JNK三者作用的上下游關系。

本研究在體內實驗初步證實了AH對ConA誘導的急性肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能與AH抑制ROS及其介導的JNK途徑有關。本研究結果將為肝損傷靶向藥物的開發(fā)及聯(lián)合用藥提供一定的實驗及理論依據(jù)。

(致謝：本研究主要在甘肅省中醫(yī)藥大學動物實驗中心及甘肅省人民醫(yī)院科研中心完成，感謝課題組成員在整個實驗中所付出的勞動。)

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