朱 婷，馮 玉，肖 靜，孫 冰

(1. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193; 2. 山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

傷口愈合是一個復雜、動態(tài)、有序的過程，包括3個不同又相互關聯(lián)的階段，即炎癥階段、新組織形成階段及組織重塑階段。首先，組織損傷引發(fā)急性炎癥反應，其中中性粒細胞、單核細胞和肥大細胞滲入損傷部位，并產(chǎn)生多種細胞因子。釋放的細胞因子能夠刺激多種細胞如角質(zhì)細胞、成纖維細胞的增殖和遷移。最后，細胞外基質(zhì)重塑、血管生成和再上皮化促使傷口閉合和疤痕形成[1-3]。

三七總皂苷是人參屬中藥三七的主要有效活性成分[4]，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡活性[5-7]。之前的研究表明，三七皂苷R1能明顯抑制多種炎癥因子的產(chǎn)生[8]，但其對皮膚創(chuàng)傷愈合的影響少有報導。因此，本實驗旨在通過制備小鼠皮膚創(chuàng)傷模型，觀察三七皂苷R1對皮膚創(chuàng)傷愈合的影響。首先，采用3種不同給藥方式(灌胃給藥、腹腔給藥、皮膚給藥)給予三七皂苷R1，觀察不同給藥方式對皮膚創(chuàng)傷愈合的影響?；谘装Y反應在皮膚組織損傷過程中占有重要地位，我們進一步從組織形態(tài)學、分子生物學等多個水平，探討三七皂苷R1對皮膚創(chuàng)傷愈合及創(chuàng)面炎癥反應的作用，為進一步深入研究其機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級ICR小鼠，♂，8周齡，體質(zhì)量(23±2) g，購自北京維通利華動物技術有限公司。飼養(yǎng)條件：于實驗前1周購進ICR小鼠，動物置于溫度(25～27)℃ SPF級動物實驗室內(nèi)，動物自由攝食，飲水。

1.1.2藥品與試劑 三七皂苷R1，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品批號：160902；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，購自Sigma公司；ELISA試劑盒、RT-PCR試劑盒及引物均購自鼎國昌盛生物技術有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為去離子水。

1.1.3儀器 BDS200型顯微鏡(OPTEC公司)；M1000多功能連續(xù)波長酶標儀(瑞士Tecan公司)；7500型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立 ICR小鼠40只，0.5%戊巴比妥鈉15 mg· kg-1腹腔注射麻醉，用電動理發(fā)器對小鼠整個背部剃毛，涂抹脫毛膏將剩余毛發(fā)除盡。背部皮膚酒精消毒后，用生理鹽水對背部皮膚進行擦拭，提拉皮膚中線，用直徑為5 mm的圓形打孔器對小鼠背部皮膚進行打孔，左右各1孔。酒精消毒，致傷后單籠飼養(yǎng)。將打孔成功的小鼠隨機分為4組，每組10只： ①對照組 (Control組)：腹腔注射氯化鈉溶液；②灌胃組(ig組)： 每天灌胃給予三七皂苷R1；③腹腔注射組(ip組)：每天腹腔注射三七皂苷R1；④經(jīng)皮給藥組(tdd組)：創(chuàng)面每天涂抹三七皂苷R1。各給藥組三七皂苷R1劑量為每天30 mg·kg-1，持續(xù)給藥14 d，分別于d 0、1、3、5、7、9、11、13、14進行拍照，采用Image-J軟件計算傷口面積，并按下列公式進行計算，結(jié)果以百分數(shù)表示。傷口面積/%=實際傷口面積 /d 0傷口面積。統(tǒng)計d 13、14傷口完全閉合老鼠只數(shù)，按下列公式計算傷口閉合率：傷口閉合率=傷口完全閉合只數(shù)/總只數(shù)×100%。

1.2.2病理組織學切片HE染色 取腹腔注射組d 7皮膚傷口邊緣及周圍0.5 cm 左右寬的組織，將組織塊置于4%多聚甲醛中固定5 d后，常規(guī)石蠟包埋后備用。將蠟塊常規(guī)脫水，包埋，切片后，行HE染色，光鏡觀察皮膚及肉芽組織結(jié)構(gòu)改變[9]。對傷口再上皮化百分比進行統(tǒng)計，再上皮化百分比=(真皮邊緣間距-上皮邊緣間距)/真皮邊緣間距×100%。

1.2.3ELISA分析 ELISA法檢測腹腔注射組d 1、3、7，腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素-1β (interleukin-1 beta，IL-1β)、血管細胞黏附因子-1 (vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1) 蛋白表達變化。將皮膚傷口組織剪碎，勻漿器勻漿，離心取組織液上清。根據(jù)試劑盒說明書操作，酶標儀450 nm波長處測定吸光度(A)值[8]。

1.2.4實時定量RT-PCR分析 實時定量RT-PCR法檢測腹腔注射組d 7的I型膠原α1鏈 (collagen type Ⅰ alpha 1 chain，COL1A1)、Ⅲ型膠原α1鏈(collagen type Ⅲ alpha 1 chain，COL3A1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)、血小板源性生長因子 (platelet derived growth factor，PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 的mRNA表達水平。使用TRIzol試劑分離皮膚樣品的總RNA。用Prime Script RT Master Mix試劑盒合成cDNA。使用SYBR green premix進行實時聚合酶鏈反應。引物序列見Tab 1[10]。 使用delta delta CT方法，所有基因表達均與內(nèi)參照基因(β-actin)的標準化相同。實驗結(jié)果由熒光定量PCR分析軟件 Applied Biosystems Primer Express Software (version 2.0) 自動進行統(tǒng)計和計算[8]。

Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1三七皂苷R1不同給藥方式對小鼠皮膚傷口閉合的影響

2.1.1小鼠創(chuàng)面形態(tài)學觀察 如Fig 1A所示，手術后d 3，給藥組較對照組皮膚創(chuàng)面滲出液減少，傷口周圍干燥，腫脹范圍較小，且紅色肉芽組織開始生長，表面紅潤，傷口周圍上皮開始收縮。這些癥狀于手術后d 7更為明顯。隨著時間的延長，給藥組傷口面積減少速度明顯高于對照組，而腹腔注射給予三七皂苷R1在不同給藥方式中效果最明顯。

2.1.2對小鼠傷口面積統(tǒng)計 對術后d 1、3、7、14小鼠傷口面積進行計算，由Fig 1B結(jié)果可見，與對照組相比，手術后d 3、7三七皂苷R1各不同給藥方式組傷口面積均有不同程度減小。手術后d 14，腹腔注射組與灌胃組差異明顯，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.1.3總閉合率的統(tǒng)計 對手術后d 13、14傷口總閉合情況進行統(tǒng)計，如Fig 2所示，手術后d 13時，傷口總閉合率雖有提升，但并不明顯；手術后d 14，各種給藥方式給予三七皂苷R1傷口總閉合的比例均有增加。腹腔注射組接近90%的小鼠傷口全部閉合，而對照組只有25%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 1 Effect of R1 on wound area in ICR mice by different ways of administration

A: Photographs of healing wounds of control and notoginsenoside R1 mice up to 7 days after wounding(scale bar=5 mm); B: Changes in wound area compared to day 0 (n=10).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsig. group.

Fig 2 Mice with total wound closure on day 13 and 14 after injury

Day 13: Control (2/8), ig. (4/8), ip. (6/8), tdd (5/8); Day 14: Control (2/8), ig. (6/8), ip. (7/8), tdd (6/8).*P<0.05vscontrol group.

2.2三七皂苷R1對小鼠皮膚傷口再上皮化的影響在傷口重新上皮化和肉芽組織形成過程中，角質(zhì)細胞遷移是評估傷口愈合成功的早期標記[2]。Fig 3A的HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，手術后d 7腹腔注射三七皂苷R1組角質(zhì)細胞的遷移速度較快，以左側(cè)圖片粗細箭頭之間的距離增大為證；Fig 3B進一步對傷口再上皮化過程進行定量分析，結(jié)果同樣證實三七皂苷R1腹腔注射治療的傷口重上皮化的比率明顯高于對照組。

Fig 3 HE staining of wounds on day 7 post injury in ICR mice

A: Black arrowheads indicate edges of epithelium (right images), scale bar= 1 mm. Left images indicate migration of keratinocytes. Thick arrowhead indicates the beginning of migration, and thin arrowhead indicates the end of migration. Scale bar=0.2 mm. EG: epithelial gap. B: The quantified data for re-epithelialization(n=4).*P<0.05vscontrol group. R1 indicates notoginsenoside R1.

2.3三七皂苷R1對小鼠皮膚傷口TNF-α、IL-1β、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達水平的影響Fig 4的ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，腹腔注射三七皂苷R1組皮膚傷口組織的TNF-α含量在d 3、7時均降低(P<0.05)，且d 3時差異較明顯(P<0.01)；IL-1β水平在d 3、7稍有降低，但差異無統(tǒng)計學意義；與對照組相比，腹腔注射三七皂苷R1組皮膚傷口組織ICAM-1和VCAM-1蛋白表達在d 3、7時均降低(P<0.05)，且VCAM-1水平在d 7差異明顯(P<0.01)。以上數(shù)據(jù)表明，在傷口形成后d 3、7，腹腔注射三七皂苷R1明顯降低除IL-1β以外的炎癥因子水平。

Fig 4 Effect of R1 on inflammation in ICR wounds

Wound tissues were collected on day 1, 3 and 7 for ELISA analysis. Inflammatory mediators were evaluated.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group. R1 indicates notoginsenoside R1.

Fig 5 Effect of R1 on collagen production and neovascularization in ICR wounds

mRNA expression of COL1A1, COL3A1, TGF-β1, PDGF and VEGF in wounds on day 7 post-injury were analyzed.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group. R1 indicates notoginsenoside R1.

2.4三七皂苷R1對小鼠皮膚傷口組織COL1A1、COL3A1、TGF-β1、PDGF、VEGF基因表達的影響Fig 5實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，手術后d 7腹腔注射三七皂苷R1組COL1A1、COL3A1 mRNA表達水平均有不同程度的升高。腹腔注射三七皂苷R1同樣可以上調(diào)TGF-β1、PDGF、VEGF的mRNA表達水平。

3 討論

傷口愈合是指機體受到外力的作用，皮膚等組織表現(xiàn)出缺損后的愈合修復過程。延遲傷口愈合通常會導致局部感染，并可能潛在地導致慢性、無法愈合的傷口[11]。由巨噬細胞分泌的炎癥因子，特別是TNF-α，對于真皮成纖維細胞和上皮細胞的功能起到了關鍵的調(diào)控作用，因此，巨噬細胞在創(chuàng)傷愈合過程中具有中心調(diào)節(jié)地位。研究已證實，TNF-α可以抑制傷口中I型膠原蛋白的表達，并且能夠抑制TGF-β1誘導的肌成纖維細胞分化[12]和真皮成纖維細胞中膠原蛋白表達[13]。這些細胞實驗結(jié)果提示，傷口組織局部TNF-α增強可以直接影響真皮成纖維細胞功能，從而抑制皮膚傷口的愈合。創(chuàng)傷后，為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，機體產(chǎn)生先天免疫防御反應，在抵抗機體損傷、修復創(chuàng)傷的同時，產(chǎn)生一系列急性期反應。在此過程中，巨噬細胞被活化，并誘導產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)(TNF-α等)。在本研究中，三七皂苷R1可以有效抑制傷口皮膚中的TNF-α表達，這說明三七皂苷R1對皮膚傷口的炎癥反應具有抑制作用。另外，研究已證實，ICAM-1、VCAM-1能夠與白細胞上的相應受體結(jié)合，進而調(diào)控白細胞黏附、遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，傷口形成后，VCAM-1和ICAM-1的蛋白水平明顯升高，腹腔注射三七皂苷R1可有效抑制二者的表達。因此，我們推測三七皂苷R1參與抑制炎癥細胞的黏附，從而促進皮膚傷口的愈合。

成纖維細胞是傷口愈合過程中肉芽組織形成的主要細胞，負責合成膠原等細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)并進行傷口的重塑[14]。它們在傷口愈合中起重要作用，包括促進膠原合成和一系列生長因子的分泌。我們的研究結(jié)果表明，在小鼠的切除傷口中，腹腔注射三七皂苷R1可以增加膠原(COL1A1、COL3A1)的mRNA表達，因此，我們推測三七皂苷R1可能通過促進膠原合成，加速皮膚傷口肉芽組織形成，進而促進傷口愈合。

新生血管形成被認為在傷口修復中發(fā)揮關鍵的病理生理作用[1]。血管生成對于滋養(yǎng)新形成的肉芽組織和角質(zhì)細胞的存活至關重要。在本研究中，腹腔注射三七皂苷R1可以誘導創(chuàng)傷組織中多種血管生成因子，如TGF-β1、VEGF、PDGF mRNA水平的明顯升高。因此，我們推測三七皂苷R1可能通過影響血管生成加速傷口愈合。

從傷口面積百分比及閉合率統(tǒng)計結(jié)果可明顯看出，3種給藥方式雖都可以有效加速傷口愈合，但腹腔注射作用最為明顯。原因可部分歸結(jié)于腹腔注射給藥，藥物通過腹膜吸收，吸收面積大，藥物直接吸收入血，快速調(diào)動機體先天免疫系統(tǒng)，控制炎癥反應，從而加速皮膚傷口愈合。另外兩種給藥方式，灌胃給藥影響藥物吸收的因素較多，肝臟消除等在一定程度上影響藥效。而經(jīng)皮給藥，因藥物直接接觸傷口表面，雖可以局部控制炎癥反應，但同時可造成傷口表面濕潤，抑制結(jié)痂，不利于傷口愈合。綜上，三七皂苷R1能夠抑制傷口組織炎癥因子釋放，在創(chuàng)傷損傷的炎癥期降低炎癥反應，減少炎性滲出，促進傷口再上皮化。這些作用有利于肉芽組織形成、膠原的合成及新血管生成，是三七皂苷R1促進創(chuàng)面愈合的潛在機制。根據(jù)本研究的結(jié)果，我們將應用腹腔注射三七皂苷R1進行后續(xù)研究，以深入研究三七皂苷R1加速皮膚傷口愈合的具體機制。

(致謝：本研究在中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心孫冰課題組實驗室完成，衷心感謝課題組人員給予的大力支持與幫助。)

[1] Gurtner G C, Werner S, Barrandon Y, et al. Wound repair and regeneration [J].Nature, 2008,453(7193): 314-21.

[2] Trautmann A, Toksoy A, Engelhardt E, et al. Mast cell involvement in normal human skin wound healing: expression of monocyte chemoattractant protein-1 is correlated with recruitment of mast cells which synthesize interleukin-4invivo[J].JPathol, 2000,190(1): 100-6.

[3] Peppa M, Stavroulakis P, Raptis S A. Advanced glycoxidation products and impaired diabetic wound healing [J].WoundRepairRegen, 2009,17(4): 461-72.

[4] 王瑞幸，戴 耄，穆云萍，等. 三七皂苷R1對肺高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞 SOCE 的抑制作用[J]. 中國藥理學通報，2015，31(10): 1463-8.

[4] Wang R X, Dai M, Mu Y P, et al. Inhibition of notoginsenoside R1 on SOCE in pulmonary arterial smooth muscle cells of pulmonary hypertension rats [J].ChinPharmacolBull, 2015，31(10): 1463-8.

[5] Zhang H S, Wang S Q. Notoginsenoside R1 from Panaxnotoginseng inhibits TNF-alpha-induced PAI-1 production in human aortic smooth muscle cells[J].VasculPharmacol, 2006,44(4): 224-30.

[6] Chen W X, Wang F, Liu Y Y, et al. Effect of notoginsenoside R1 on hepatic microcirculation disturbance induced by gut ischemia and reperfusion [J].WorldJGastroenterol, 2008,14(1): 29-37.

[7] Liu W J, Tang H T, Jia Y T, et al. Notoginsenoside R1 attenuates renal ischemia-reperfusion injury in rats[J].Shock, 2010,34(3): 314-20.

[8] Sun B, Xiao J, Sun X B, et al. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling [J].BrJPharmacol, 2013,168(7): 1758-70.

[9] 姜霽洋，徐 涵，白雪婷，等. 朱槿花苞提取物治療皮膚癤癰潰瘍及其機制研究[J]. 中國藥理學通報，2015，31(8): 1085-91.

[9] Jiang J Y, Xu H, Bai X T, et al. Research in skin healing and repair function and mechanism of Hibiscus rosasinensis Linn bud extract [J].ChinPharmacolBull, 2015，31(8): 1085-91.

[10] Zhang E, Gao B, Yang L, et al. Notoginsenoside Ft1 promotes fibroblast proliferation via PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and benefits wound healing in genetically diabetic mices [J].JPharmacolExpTher, 2016,356(2): 324-32.

[11] Lai J J, Lai K P, Chuang K H, et al. Monocyte/macrophage androgen receptor suppresses cutaneous wound healing in mice by enhancing local TNF-α expression [J].JClinInvest, 2009,119(12): 3739-51.

[12] 李漢清，可 燕. 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究進展 [J]. 中國藥理學通報，2017，33(10): 1342-4.

[12] Li H Q, Ke Y. Mechanism of epithelial-mesenchymal transition [J].ChinPharmacolBull, 2014,33(10): 1342-4.

[13] Goldberg M T, Han Y P, Yan C, et al. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing [J].J.InvestDermatol, 2007,127(11): 2645-55.

[14] Mansbridge J N, Liu K, Pinney R E, et al. Growth factors secreted by fibroblasts: role in healing diabetic foot ulcers [J].DiabetesObesMetab, 1999,1(5): 265-79.