程 敏，胡選生，程 楠，張曉文

(商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院制藥工程系，商洛市GAP科研工程中心，陜西 商洛 726000)

糖尿病是一種以高血糖為特點，由胰島素分泌不全或功能缺陷所引發(fā)的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]。糖尿病腎病是糖尿病引發(fā)的微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致死的主要原因之一[2]。糖尿病腎病發(fā)生及發(fā)展是多種因素相互作用的結(jié)果，其確切的發(fā)病機制至今尚未明了[3]。

墨旱蓮為菊科鱧腸屬植物鱧腸的干燥地上部分，具有抗蛇毒[4]、抗高血脂[5]、抗腫瘤[6]、抗真菌活性[7]。Xi等[8]采用體外α-淀粉酶和二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)對墨旱蓮的有效降糖部位進行了篩選，結(jié)果表明墨旱蓮對DPP-IV酶的抑制活性主要集中在石油醚部位。但該提取物對糖尿病大鼠血清中與糖脂代謝相關的生化指標以及糖尿病腎病的影響，國內(nèi)外鮮有報道。本研究利用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病大鼠模型，探究墨旱蓮石油醚提取物(petroleum ether extract ofEcliptaprostrata，PEEEP)對STZ誘導的糖尿病大鼠血清中血糖、胰島素、甘油三酯(total glycerides,TG)、膽固醇(total cholesterol，TC)、肌酐(creatinine，CRE)、尿素(urea nitrogen, BUN)、尿酸(uric acid，UA)等生化指標以及腎組織病理學的影響，為進一步開發(fā)利用墨旱蓮這一傳統(tǒng)的藥食兩用中草藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物墨旱蓮(購于陜西西安，經(jīng)中國中醫(yī)科學院商洛中藥材GAP科研工程中心李筱玲講師鑒定為墨旱蓮)全草300 g，以2倍量體積80%乙醇回流提取3次,每次2 h,合并提取液,減壓除去乙醇,得濃縮液。采用2倍量濃縮液體積的40%石油醚萃取，減壓濃縮,干燥,稱重,得PEEEP干粉25 g,4℃冷藏保存。臨用前，用蒸餾水將干粉配制成1、2、4 kg·L-1的藥液備用。鹽酸二甲雙胍片購自中美上海施貴寶制藥有限公司，批號: 1307093。

1.2動物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(125±6)g，購于第四軍醫(yī)大學動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2007-007。飼養(yǎng)于商洛學院動物實驗室。

1.3試劑STZ(美國 Sigma 公司)；肝素(酷爾化學科技有限公司)；TNF-α抗體(上海瑞奇生物科技有限公司)；胰島素、TC、TG、CRE、BUN、UA測定試劑盒，均為長春匯力生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.4儀器血糖儀(三諾)；7080全自動分析儀(日本日立公司)；顯微鏡及拍照系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.5動物模型的制備及分組將♂ SD大鼠60只，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組(10只)和造模組(50只)。正常對照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠給予高能飼料喂養(yǎng)8周后，隔夜禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ(溶于預冷的0.1 mL pH為4.5的磷酸緩沖液)30 mg·kg-1，3 d后尾尖取血，利用血糖儀測其空腹血糖，空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1視為造模成功[9]。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組及PEEEP低、中、高劑量組(100、200、400 mg·kg-1)，每組9只。鹽酸二甲雙胍組給予劑量為400 mg·kg-1，正常組和模型組給予等量的蒸餾水。每天早、晚灌胃2次，連續(xù)4周。實驗期間大鼠自由攝食飲水。

1.6相關指標檢測給藥4周后，大鼠禁食不禁水12～16 h，乙醚麻醉，心臟取血5 mL，3 500 r·min-1離心10 min分離血清，利用相應試劑盒分別測定大鼠血清中血糖、胰島素、TG、TC、CRE、BUN、UA含量。

1.7腎臟HE病理學檢測實驗4周后處死動物，腎臟用10%福爾馬林固定后，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察腎臟的病理學變化。

1.8Westernblot檢測采用 Western blot 法，對各組大鼠腎組織中TNF-α的蛋白表達水平進行檢測。提取腎組織中總蛋白，用半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用脫脂奶粉封閉，加入TNF-α和β-actin一抗，然后加入相應的二抗，用化學發(fā)光法顯影。對條帶進行掃描，分析條帶中吸光度值，以目的蛋白TNF-α和β-actin內(nèi)參照的吸光度值比值進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1PEEEP對糖尿病大鼠相關生化指標的影響由Tab 1可見，與正常組相比，糖尿病模型大鼠血糖明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組的血糖均有下降的趨勢，PEEEP大劑量組對大鼠空腹血糖的降低趨勢尤為明顯(P<0.01)。表明PEEEP對2型糖尿病大鼠有良好的降糖效果。與正常對照組比較，模型組胰島素含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，PEEEP低、中、高劑量組胰島素均有不同程度的提高，提高率分別為7.9%、13.2%、21.1%，表明PEEEP能夠明顯促進胰島素的分泌。

TG和 TC是高血脂癥的重要指標[10]。由Tab 1可見，模型組大鼠TC、TG含量明顯高于正常對照組，高劑量PEEEP組TC、TG含量明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)。表明PEEEP對糖尿病所引起的血脂代謝紊亂有一定的改善作用，且高劑量組的改善效果尤為明顯(P<0.05，P<0.01)。

Tab 1 Effects of PEEEP on blood glucose, insulin, TG and TC in STZ induced diabetic rats(±s, n=9)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.2PEEEP對2型糖尿病腎病的影響由Tab 2可見，與正常對照組相比，模型組大鼠的CRE、BUN、UA水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，PEEEP實驗組大鼠的CRE、BUN、UA含量均低于模型組，且隨著PEEEP濃度的增加而降低，但PEEEP低、中劑量組大鼠BUN水平無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，陽性對照組和PEEEP高劑量組大鼠的腎臟指數(shù)明顯降低(P<0.01，P<0.05)，PEEEP中、低劑量組也有一定的降低作用，但沒有統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果表明，PEEEP對STZ誘導的糖尿病腎病的腎臟損傷有一定的保護作用。

Tab 2 Effects of PEEEP on CRE, BUN, UA and kidney index in STZ induced diabetic rats(±s, n=9)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.3PEEEP對STZ糖尿病大鼠腎臟形態(tài)學的影響經(jīng)HE染色，光鏡觀察，腎組織病理形態(tài)如Fig 1所示。正常大鼠腎小球形態(tài)規(guī)則，腎小管排列整齊緊密，管腔刷狀緣清晰(Fig 1A)；模型大鼠腎小球明顯腫脹，體積增大，毛細血管袢損傷，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小囊變窄，腎小管上皮細胞有不同程度水腫浸潤、空泡變性以及壞死，腎小管內(nèi)可見脫落的細胞碎片(Fig 1B)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組腎小球腫脹明顯改善，腎小囊有所恢復，腎小管結(jié)構(gòu)趨于清晰(Fig 1C)；PEEEP高劑量組腎小球和腎小管水腫明顯減輕，腎小囊逐漸變窄，腎間質(zhì)炎性細胞減少，刷狀緣逐漸清晰(Fig 1F)；PEEEP中劑量組腎小球腫脹明顯減輕，管腔變窄，腎小管管腔逐漸清晰，刷狀緣可見(Fig 1E)；PEEEP低劑量組腎小球腫脹有所緩解，腎小管結(jié)構(gòu)也較模型組清晰(Fig 1D)。總之，PEEEP各劑量組與模型組相比較，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)均趨于正常，且與藥物劑量呈一定的量效關系，即劑量越大，腎臟組織病變程度也愈輕。

2.4PEEEP對STZ糖尿病大鼠腎臟組織中TNF-α蛋白表達的影響Western blot檢測各組大鼠腎臟組織中TNF-α蛋白的表達，如Fig 2所示，與正常組相比，模型組大鼠TNF-α蛋白表達明顯增加，PEEEP各劑量組和陽性對照組均能不同程度地下調(diào)TNF-α蛋白的表達，且PEEEP高、中劑量組效果明顯(P<0.05)。

3 討論

胰島素是胰島β細胞分泌的唯一能夠降低血糖的激素。本研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠血清中胰島素含量隨PEEEP給藥濃度的增加而升高，表明PEEEP能夠促進胰島素分泌，可能是其有效降低血糖的作用機制之一。Hu等[12]研究顯示，高水平的甘油三酯和膽固醇是糖尿病誘發(fā)動脈粥樣硬化和冠心病的首要因素。Zhao等[5]和Kim等[11]研究表明，墨旱蓮提取物能夠有效降低低密度膽固醇，同時提高高密度膽固醇。本研究表明，PEEEP能明顯降低STZ誘導的2型糖尿病大鼠的甘油三酯和膽固醇水平。由此可見，PEEEP具有改善糖尿病患者血脂異常，降低患動脈粥樣硬化和冠心病風險的潛力。

Fig 1 Effects of PEEEP on kidney in STZ induced diabetic rats(HE staining, ×200)

A: Normal; B: Model; C: Metformin 400 mg·kg-1; D: PEEEP 100 mg·kg-1; E: PEEEP 200 mg·kg-1; F: PEEEP 400 mg·kg-1. 1: Glomeruli; 2: Renal capsules; 3: Glomerular capillary loop; 4: Proximal convoluted tubule; 5: Distal convoluted tubule.

Fig 2 Effects of PEEEP on expression of TNF-α protein in STZ induced diabetic rats kidney

1: Normal; 2: Model; 3: Metformin 400 mg·kg-1; 4:PEEEP 100 mg·kg-1; 5: PEEEP 200 mg·kg-1; 6: PEEEP 400 mg·kg-1.*P<0.05,**P<0.01vsmodel

本研究結(jié)果顯示，PEEEP高劑量能夠明顯降低腎功能指標尿酸和肌酐水平。糖尿病腎病是糖尿病并發(fā)癥之一，本實驗發(fā)現(xiàn)PEEEP除了能夠降低血糖、血脂，升高胰島素含量外，對糖尿病模型大鼠的腎臟具有一定保護作用，高劑量組效果尤為明顯。尿酸是人體嘌呤代謝途徑的最后代謝產(chǎn)物，血液中高尿酸是高尿酸血癥的特征，降低尿酸水平是預防和治療痛風的有效途徑之一[13]。本實驗中模型組大鼠尿酸水平明顯高于正常組，該結(jié)果與Yuan等[14]的研究結(jié)果一致，而PEEEP各劑量組均能夠明顯降低尿酸水平，高劑量效果尤為明顯,表明PEEEP對痛風有一定的改善作用。

宋霖等[15]研究表明，TNF-α是體內(nèi)重要的、具有廣泛生物活性的細胞因子，TNF-α在2型糖尿病血清中明顯升高，并隨著腎臟損傷出現(xiàn)進一步升高。本研究中，模型組大鼠腎臟組織中TNF-α表達增加，而PEEEP各劑量組TNF-α表達下降，表明PEEEP可能通過抑制模型大鼠腎臟組織中TNF-α的表達，從而發(fā)揮腎臟保護作用。本研究首次評價PEEEP對STZ糖尿病大鼠的生化指標以及腎組織病理學的影響，其毒性以及有效成分有待進一步分析。

綜上所述，本研究通過建立的糖尿病腎病大鼠模型，證實PEEEP可降低糖尿病大鼠血糖、血脂、尿素、尿酸、肌酐含量，提高胰島素含量，同時對腎臟有一定的保護作用，為墨旱蓮的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

(致謝：本實驗主要在商洛學院動物實驗室完成，感謝課題組所有成員對實驗的指導與幫助。)

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