王永恒　李林瑞　雷雨

摘 要：目的 探討緩釋血管內(nèi)皮生長因子復(fù)合支架與脂肪干細(xì)胞構(gòu)建工程化脂肪的可行性。方法 制備VEGF-PLGA納米微球緩釋支架，檢測支架釋放 VEGF 濃度，體外提取培養(yǎng) ADSCs，檢測復(fù)合支架對 ASC 生長增殖的影響。將復(fù)合支架和ADSCs植入裸小鼠背部，8 周后切取植入物稱重，組織切片HE染色，評估效果。結(jié)果 VEGF-PLGA納米微球緩釋復(fù)合支架能連續(xù) 12 d釋放較高濃度的VEGF，對 ADSCs的生長增殖無影響。動物實驗結(jié)果顯示復(fù)合支架與ADSCs共移植能顯著提高脂肪組織的形成，增加血管的生成（P<0.01），減少組織壞死。結(jié)論 VEGF-PLGA納米微球緩釋系統(tǒng)具有良好的生物安全性，其與ADSCs共移植構(gòu)建工程化脂肪組織具有一定的可行性。

關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮生長因子；緩釋支架；脂肪干細(xì)胞；工程化脂肪

中圖分類號：R622+.9 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.22.018

文章編號：1006-1959（2018）22-0064-03

Study on the Relationship between Human Adipose Stem Cells and VEGF-PLGA Nanospheres Slow-release System for Construction of Engineered Adipose Tissue

WANG Yong-heng1，LI Lin-rui1 ，LEI Yu2，HUO Bin-liang1，CAO Wei1

（ Department of Surgical Oncology1，Department of Oncology2，Shaanxi Provincial People's Hospital，Xi'an 710068，Shaanxi，China）

Abstract：Objective To investigate the feasibility of construction of engineered adipose tissue with sustained-release vascular endothelial growth factor（VEGF） composite stent and adipose stem cells.Methods VEGF-PLGA nanospheres sustained-release scaffolds were prepared and the concentration of VEGF was measured. ADSCs， was extracted in vitro to detect the effect of composite scaffolds on the growth and proliferation of ASC.The composite scaffold and ADSCs were implanted into the back of nude mice. After 8 weeks， the implants were weighed， and the tissue sections were stained with HE to evaluate the effect.Results VEGF-PLGA nanospheres sustained-release composite scaffolds could release higher concentration of VEGF， for 12 d without any effect on the growth and proliferation of ADSCs.The results of animal experiments showed that co-transplantation of composite scaffold and ADSCs could significantly increase the formation of adipose tissue， increase angiogenesis （P<0. 01）， and reduce tissue necrosis.Conclusion VEGF-PLGA nanospheres sustained-release system has good biological safety and it is feasible to co-transplant with ADSCs to construct engineered adipose tissue.

Key words：Vascular endothelial growth factor；Sustained-release scaffold；Adipose-derived stem cells；Engineered adipose tissue

脂肪干細(xì)胞 （adipose-derived stem cells，ADSCs）是來源于脂肪組織的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能，其應(yīng)用于乳房重建的優(yōu)勢是組織來源充足、取材簡便，同時其無免疫排異的風(fēng)險，能用于自體移植、同種異體移植，甚至異種移植[1]。臨床上常見有因乳房發(fā)育不良、腫瘤切除、外傷等原因引起的小乳癥、乳房的缺失等，可能引起患者嚴(yán)重的身心障礙?，F(xiàn)有的乳房填充材料存在生物相容性差、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差等缺點。尋找合適的乳房重建材料是目前乳腺外科研究的重點。自體脂肪組織是目前進行乳房填充和重建的最佳材料，但其來源受到很大限制，并且效果不穩(wěn)定。自體脂肪顆粒移植存活率低，且易發(fā)生壞死、液化、纖維化、鈣化等，難以大量獲取，故難以廣泛應(yīng)用。而隨著材料學(xué)的發(fā)展，各種緩釋支架的應(yīng)用在為誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、促進血管生成和增加血供并提高植入物的存活率提供了新的思路[2，3]。本研究首先提取培養(yǎng) ADSCs，再制備能血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 緩釋聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米微球復(fù)合支架（polylactic-co-glycolic acid，PLGA），將ADSCs與復(fù)合支架植入裸小鼠的背部，通過測量植入物的重量、組織切片 HE 染色觀察，探討ADSCs和復(fù)合支架移植進行組織工程化脂肪構(gòu)建的可行性。

1材料和方法

1.1主要試劑 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF蛋白，50 μg）購自 PeproTech 公司；Ⅰ型膠原酶（60 U）購自Sigma公司；VEGF- ELISA試劑盒（96 t）購自北京健平九星生物醫(yī)藥科技有限公司；水溶性四唑鹽 WST-1試劑（100 mg）購自東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2實驗動物及分組 選擇 4～6 周齡雌性裸小鼠10只（空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供），所有實驗動物均在該中心SPF級動物房中分籠飼養(yǎng)，飲水、飼料等物品均滅菌處理后使用，實驗操作按無菌原則進行。

1.3實驗方法

1.3.1脂肪干細(xì)胞提取和培養(yǎng) 脂肪組織來源于我院腫瘤外科行副乳切除的脂肪組織，總量約10 ml，剪成約為1 mm3 的小塊，PBS反復(fù)沖洗。加入0.1% Ⅰ型膠原酶進行原代細(xì)胞分離和接種培養(yǎng)。24 h后換液1次，以后每2～3 d換液，待細(xì)胞密度達80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。選取生長良好的第3代細(xì)胞做多向分化及體內(nèi)實驗，觀察原代及傳代脂肪干細(xì)胞ADSCs形態(tài)及生長狀況。

1.3.2血管內(nèi)皮生長因子-聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球制備 VEGF蛋白溶解得到內(nèi)水相（W2）。PLGA 溶入二氯甲烷溶液中，作為油相（O）。將W2 移入O中，渦旋振蕩后得到初乳。將初乳加入體積分?jǐn)?shù)5%聚乙烯醇溶液[外水相（W1）]中，磁力攪拌后，得到W/O/W乳液。將此乳液轉(zhuǎn)移到 124 ℃、100 ml 5 g/L的氯化鈉水溶液中，攪拌后收集固化的蛋白微球，用超純水洗滌 3遍，冷凍干燥備用。將適量 VEGF-PLGA 微球分散在導(dǎo)電雙面膠上的鋁箔紙上，噴金后，置于電鏡下觀察。

1.3.3 ADSCs增殖影響的測定 取第3代ADSCs，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×104個/ml，接種于 96 孔板中，每孔加入100 μl懸液。每組設(shè)3個復(fù)孔，A組為單純細(xì)胞懸液，B組每孔加入 50μg復(fù)合支架粉末，置于 37 ℃、 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 24 h取1塊板，每孔加入10μl的WST-1工作液，于37 ℃恒溫箱孵育2.5 h，使用酶標(biāo)儀450 nm波長測定吸光度（OD）值，記錄結(jié)果，連續(xù)測8 d。

1.3.4支架與 ADSCs 的裸小鼠移植 動物實驗按照西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理審查委員會相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。取4～6周齡雄性無胸腺鼠10只，2%戊巴比妥麻醉后，在背部脊椎兩側(cè)各選取1個位置，一側(cè)植入脂肪干細(xì)胞-VEGF-PLGA納米緩釋復(fù)合物，同樣方法在另一側(cè)植入無支架細(xì)胞液，術(shù)后肌肉注射青霉素鈉預(yù)防感染。8周后，處死裸小鼠，觀察移植區(qū)域內(nèi)有無新生組織形成，大體觀察新生組織的形態(tài)及支架殘留情況，完整取出植入物，測量植入物的重量。同時將植入物放入戊二醛緩沖液中固定，行蘇木精-伊紅染色（HE染色）。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 用 SPSS 13.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 VEGF-PLGA的復(fù)合支架的表面特征 掃描電鏡觀察顯示：VEGF-PLGA呈圓形球體，形態(tài)較一致，表面光滑無孔隙，無粘連，無塌陷及萎縮現(xiàn)象，其粒徑為 4～10 μm，見圖 1。

2.2復(fù)合支架中 VEGF的體外釋放動力學(xué) 用ELISA試劑盒測定VEGF的體外緩釋效果。經(jīng)檢測， VEGF-PLGA微球釋藥率為（20.00±1.84）% ，復(fù)合支架于第3天達到VEGF最高釋放濃度，約為1900 pg/ml，從第4天開始釋放量逐漸減少，至第12天釋放濃度仍維持在 600 pg/ml 以上，見圖2。

2.3 ADSCs的形態(tài)及活性測定 原代細(xì)胞培養(yǎng)6 h后開始有少量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞散在貼壁，24 h后大部分貼壁細(xì)胞呈寬大扁平的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，隨培養(yǎng)時間延長，貼壁細(xì)胞呈典型的長梭形。連續(xù)傳代培養(yǎng)至15代，細(xì)胞未出現(xiàn)明顯衰老現(xiàn)象，見圖3。WST-1 法測定ADSCs的生長曲線， 同時檢測復(fù)合支架對ADSCs增殖力的影響。ADSCs在培養(yǎng)4 d 后進入對數(shù)生長期，第6天進入生長平臺期。 復(fù)合支架與ASC 共培養(yǎng)的生長曲線與 ASC 的生長曲線基本吻合，復(fù)合支架對增殖無明顯影響（見圖4）。

2.4復(fù)合支架對ADSCs移植的影響 植入后動物生長情況良好，移植后8 周觀察植入物的性狀（見圖5）。實驗組可見血管增生并長入材料，有輕度纖維包裹現(xiàn)象；對照組有少量血管增生，也有輕度纖維包裹現(xiàn)象。兩組新生組織濕質(zhì)量分別為（0.13±0.01） g和（0.09± 0.01） g，統(tǒng)計學(xué)意義顯著（P<0.01）。

兩組移植物與皮下筋膜間界面清晰，充滿細(xì)胞成分，蘇木精-伊紅染色均可見移植物中有新生脂肪組織形成和不同程度的微血管長入新生組織中，實驗組仍有部分支架材料未被降解吸收，對照組組織內(nèi)部出現(xiàn)缺血壞死（見圖6）。組織切片 HE 染色結(jié)果顯示兩組微血管數(shù)分別為（40.52±3.63）條/200 倍視野和（16.81±2.92）條/200倍視野，統(tǒng)計學(xué)意義顯著（P<0.01）。

3討論

細(xì)胞因子是組織工程中三大重要因素之一。應(yīng)用足量的生長因子可促進組織工程化脂肪組織的形成。合理將細(xì)胞因子整合入組織工程支架是目前干細(xì)胞組織工程研究的熱點。外源性生長因子的引入主要可通過培養(yǎng)液中直接添加[4]、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達[5]以及構(gòu)建緩釋多聚體[6]等方法來實現(xiàn)。直接添加的生長因子在體內(nèi)半衰期非常短，難以持續(xù)發(fā)揮作用，反復(fù)注射價格昂貴，并有可能引起毒性和免疫反應(yīng)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可使種子細(xì)胞表達重組促血管生成生長因子，并釋放促血管生成生長因子，但基因轉(zhuǎn)染技術(shù)目前僅停留在實驗室階段，其遠(yuǎn)期安全性仍有待進一步觀察。用微球顆粒和納米顆粒包裹生長因子或藥物來作為緩釋載體，取得了較理想的結(jié)果。本研究使用的PLGA支架能緩釋細(xì)胞因子，復(fù)合支架能連續(xù) 12 d釋放較高濃度的VEGF，基本達到緩釋的效果，且釋放量能維持VEGF的有效作用濃度。復(fù)合支架與 ADSCs共培養(yǎng)的生長曲線顯示，復(fù)合支架對 ASC 的生長增殖無明顯影響，表明VEGF-PLGA復(fù)合支架具有良好的生物相容性和安全性。

組織工程組織的構(gòu)建受限于構(gòu)建組織的血管化程度。選擇與血管生成相關(guān)的生長因子，可以增強組織工程化脂肪的血管化，從而加速血運的建立，減少脂肪細(xì)胞的壞死和吸收。在所有的生長因子中，VEGF對于血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用是最直接、最專一的[7，8]。應(yīng)用干細(xì)胞進行組織再造時，體外注射 VEGF 或?qū)?VEGF 基因?qū)敫杉?xì)胞可顯著增加新生血管的數(shù)量，減少再造組織的缺血壞死[9]，但其應(yīng)用因半衰期短及價格昂貴而受到制約。

支架材料為組織工程的構(gòu)建提供必要的細(xì)胞黏附增殖的空間，性能優(yōu)良穩(wěn)定的支架材料對構(gòu)建組織工程脂肪必不可少[2，3]。PLGA 由乳酸和羥基乙酸這 2 種單體聚合而成，是一種可降解的高分子有機化合物，具有良好的生物相容性，廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。PLGA 作為應(yīng)用最早最成熟的可生物降解微球的骨架材料，具有延緩藥物降解、延長藥物釋放時間、靶向釋放、降低藥物毒性和刺激性等優(yōu)點[10]。本實驗亦采取PLGA作為骨架材料，構(gòu)建納米緩釋微球，并于實驗中取得了良好的效果，且實驗發(fā)現(xiàn)與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)8周，其支架材料仍未被完全降解吸收，說明PLGA作為支架材料具有很高的穩(wěn)定性。

本實驗將ADSCs與緩釋 VEGF 的復(fù)合支架一起移植到裸小鼠的背部，移植物8周后取出，組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組均見新生脂肪組織形成，實驗組的平均濕質(zhì)量和新生微血管數(shù)大于對照組，由此可見VEGF-復(fù)合支架能提高脂肪干細(xì)胞的成脂分化能力，并促進移植物種子細(xì)胞的存活及血管化過程，因而可構(gòu)建出體積較大的組織工程脂肪。

綜上所述，本研究采用的血管內(nèi)皮生長因子-聚乳酸-羥基乙酸共聚物（VEGF-PLGA）緩釋支架具備良好生物安全性，能較長時間釋放較高劑量的 VEGF。且復(fù)合支架與ADSCs共同移植能生成更多的新生脂肪及新生微血管。其與 ASC 共移植構(gòu)建工程化脂肪組織具有一定的可行性。

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收稿日期：2018-8-26；修回日期：2018-9-5

編輯/肖婷婷