汪婧瑜，張業(yè)輝，張友勝，劉學(xué)銘，張炫，陳智毅，程鏡蓉，王旭蘋

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）（2.廣東寶桑園健康食品有限公司，廣東廣州 510610）

鐵元素在人體內(nèi)是許多關(guān)鍵酶功能特性所必需的元素，在生理代謝、氧轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)和DNA合成、免疫功能、細(xì)胞分裂和細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面也發(fā)揮著重要作用[1,2]。目前，鐵缺乏已經(jīng)成為全球性的問題，在貧血和神經(jīng)退行性疾病等方面已包含廣泛的臨床反應(yīng)[1]。如何維持機(jī)體鐵元素的平衡已成為亟需解決的問題。有研究表明，可以從膳食中補(bǔ)充鐵元素，但是日常膳食中的植酸、草酸和磷酸等物質(zhì)會抑制鐵的吸收[3]。而無機(jī)鐵元素補(bǔ)充劑的生物利用率低，因而，肽-鐵螯合物作為新型的有機(jī)鐵元素補(bǔ)充劑受到人們的廣泛關(guān)注。研究表明，肽-鐵螯合物使得鐵元素利用小分子肽在小腸中易吸收的模式提高其生物利用度，促進(jìn)鐵元素的吸收。鄭炯等[4]以Wistar品系初斷乳大鼠為缺鐵貧血模型，通過比較血紅蛋白多肽螯合鐵、葡萄糖酸亞鐵和氯化亞鐵對改善大鼠缺鐵性貧血的效果，發(fā)現(xiàn)螯合鐵使大鼠的體重、血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清鐵水平等顯著升高，說明螯合鐵具有補(bǔ)鐵的功效；陳樂群等[5]通過斷乳Wistar雌鼠缺鐵貧血模型研究證實(shí)亞鐵血紅素肽螯合物具有很好的補(bǔ)鐵功能，能促進(jìn)鐵離子的吸收。

烏鱧(Channa argus)是一種營養(yǎng)價(jià)值非常高的底棲淡水魚類，其魚肉中含有多種氨基酸及人體必需的微量元素鈣、磷、鐵和維生素，具有去瘀生新、滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)等功效[6]。因肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，烏鱧主要以鮮食為主，其應(yīng)用研究還很少。因而將高蛋白低脂肪的烏鱧進(jìn)行高值化加工利用顯得尤為重要。目前，以烏鱧為原料制備烏鱧螯合鐵還未見報(bào)道。本研究通過分析螯合工藝對鐵離子螯合率的影響、螯合鐵的結(jié)構(gòu)特征，旨在為烏鱧的高值化利用提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 原料

烏鱧購自廣州天河區(qū)世紀(jì)聯(lián)華超市，挑選大小均一，鮮活的魚為實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2 試劑

胰蛋白酶（牛胰，250 U/mg），購自廣州齊云生物技術(shù)有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、氯化亞鐵、鄰菲羅啉、鹽酸羥胺、維生素C、十二水合硫酸鐵銨、醋酸銨，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器

數(shù)顯電子分析天平，德國Sartorius公司；精密數(shù)顯pH計(jì)，德國Sartorius公司；高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司；真空冷凍干燥機(jī)，美國Laconic公司；FT-IR紅外光譜儀，美國Nicolet公司；S7130氨基酸全自動分析儀，德國Siam公司；Leo-1530vp場發(fā)射電子掃描顯微鏡，德國LEO公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；JEM2100透射顯微鏡，日本電子株式會社。

1.2 方法

1.2.1 烏鱧短肽螯合鐵的制備

參照林慧敏等[7]的方法。

烏鱧魚肉→4倍體積的冰水→勻漿→調(diào)pH至8→浸提60 min→離心→上清液→調(diào)pH至5→離心→沉淀→調(diào)pH至7→魚肉蛋白→調(diào)pH至6.5→胰蛋白酶酶解→離心→中間清夜→加入抗氧化劑Vc→按比例加入氯化亞鐵→調(diào)pH→振蕩反應(yīng)→醇沉離心→沉淀→鼓風(fēng)干燥→烏鱧短肽螯合鐵

1.2.2 螯合率的測定

采用鄰菲羅啉[8]法進(jìn)行測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)，0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，依次加入1 mol/L的HC1溶液1 mL，10%的鹽酸羥胺1 mL，0.12%鄰菲羅啉1 mL，然后加入醋酸鈉溶液5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。以不加鐵的試劑空白溶液作參比液，在510 nm波長處測定吸光度。以鐵離子溶度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.04x+0.0023，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

樣品測定：取適量的樣品置于100 mL燒杯中，加入2 mL濃鹽酸，待樣品完全溶解后，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中。準(zhǔn)確吸取5 mL樣品液于50 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟測定吸光度。

式中：C，標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的樣品試液相應(yīng)的鐵含量，μg；m，樣品的質(zhì)量，g；V1，測定時(shí)所取樣品試液的體積，mL；V0，樣品處理后的定容體積，mL；m1，螯合物中鐵的量，mg；m0，加入反應(yīng)體系中鐵的量，mg。

1.2.3 單因素優(yōu)化工藝研究

以螯合率為指標(biāo)，以加酶量、pH值、短肽與氯化亞鐵質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為考察因素，設(shè)定基本條件為加酶量35000 U/g、pH 6.0、質(zhì)量比3:1、時(shí)間30 min、溫度25 ℃，改變其中一個(gè)條件，固定其他條件（其中氯化亞鐵含量為0.1 g），考察各因素對螯合率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化工藝研究

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取pH值、質(zhì)量比、加酶量為試驗(yàn)因素，以螯合率為評價(jià)指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken方法進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)（參見表1）。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 螯合鐵的結(jié)構(gòu)分析

氨基酸組成分析：采用GB/T 5009.124-2003法；

紫外光譜掃描分析：將短肽和螯合鐵分別配制成1 mg/mL水溶液，室溫下測定其紫外吸收光譜，掃描范圍為190～400 nm；

紅外光譜掃描分析：將短肽和螯合鐵分別與溴化鉀充分研磨壓片，室溫下掃描其紅外光譜，掃描范圍為400～4000 cm-1；

掃描電鏡分析：將短肽和螯合鐵粉末均勻涂在樣盤雙面膠上，噴金鍍膜處理后，利用Leo-1530vp場發(fā)射型電子掃描顯微鏡進(jìn)行研究；

透射電鏡分析[9]：取一定量短肽和螯合鐵樣品，制成1 mg/mL的溶液，吸取1 μL樣品滴加在載有碳膜的銅網(wǎng)上，常溫下自然晾干，于JEM2100透射顯微鏡下，觀察其形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)采用SPSS、Design-Expert軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用Duncan法進(jìn)行多重比較。采用Origin軟件進(jìn)行畫圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同單因素對烏鱧短肽螯合率的影響

表2 各單因素對螯合率影響的顯著性分析Table 2 The significant analysis of the effect of single factor on the chelating rate

由表2可知，烏鱧短肽螯合鐵的螯合率隨著加酶量的增加，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在35000 U/g時(shí)達(dá)到最大值79.54%，且與其他組存在顯著差異。隨著pH值的升高，螯合率逐漸增加，當(dāng)pH為6.0時(shí)，螯合率達(dá)到最大值78.44%，與其它組存在極顯著差異。質(zhì)量比對螯合率的影響較大，隨著質(zhì)量比的增加，螯合率先增加后降低，在質(zhì)量比為3:1時(shí)，螯合率達(dá)到最高，且與其它組存在顯著差異。反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對螯合率的影響不大。25 ℃是最佳螯合溫度，此時(shí)螯合率達(dá)到最高值75.68%；反應(yīng)時(shí)間為30 min，螯合率達(dá)到最高值75.36%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

試驗(yàn)具體設(shè)計(jì)組合、試驗(yàn)值和軟件預(yù)測值見表3，得到螯合率Y對自變量pH（X1）、質(zhì)量比（X2）、加酶量（X3）的二次多元回歸方程，見公式3。

由表4知，總決定系數(shù)R2=0.9965，R2adj=0.9920，表明自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著?；貧w方程達(dá)到極顯著水平（p<0.01），表明不同條件下螯合率的差異顯著性。失擬項(xiàng)不顯著（p>0.05），表明該方程對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好。各項(xiàng)系數(shù)的顯著性分析表明，因素1X1、X3的對螯合率的影響極顯著（p<0.01），二次項(xiàng)X12、X22、X32都極顯著，交互項(xiàng)中X1X2、X2X3極顯著。三個(gè)因素中pH和加酶量對螯合率有極顯著影響，且pH值>加酶量?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將得到的最佳螯合條件pH 6.25、質(zhì)量比3.1:1、加酶量33933.14 U/g校正為pH 6.0、質(zhì)量比3:1、加酶量35000 U/g，在此條件下，螯合率的理論值達(dá)到86.24%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最優(yōu)條件下的螯合率為84.46%，與理論值的相對誤差不大，說明該模型進(jìn)行預(yù)測可行。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 3 The response surface experiment schemes and experiment results

3 0 0 0 85.78 4 0 0 0 86.34 5 0 -1 1 50.54 6 0 0 0 85.34 7 -1 1 0 52.29 8 0 0 0 85.23 9 -1 0 1 65.42 10 -1 -1 0 71.67 11 0 1 -1 55.67 12 -1 0 -1 69.43 13 1 0 -1 75.34 14 1 -1 0 58.27 15 0 -1 -1 69.32 16 0 1 1 64.00 17 1 1 0 73.29

表4 回歸方程的方差分析Table 4 The variance analysis of regression equation

2.3 螯合鐵的氨基酸組成成分分析

烏鱧短肽與螯合鐵的氨基酸組成分如表5所示。從表5可以看出，烏鱧短肽與螯合鐵中Glu、Asp含量較高，但是與短肽相比螯合鐵中Asp和Glu的含量增加。

這說明酸性的Asp和Glu與亞鐵離子有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可能是因?yàn)檫@兩種氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上的羧基與亞鐵離子發(fā)生更多的螯合[10]。高菲等[11]也證實(shí)海洋魚骨膠原肽與鈣離子螯合后，其Asp和Glu含量增加，說明Asp和Glu螯合鈣離子的能力強(qiáng)。

表5 短肽和螯合鐵的氨基酸組成Table 5 Amino acid compositionof short peptide and chelating iron

注：由于酸水解導(dǎo)致Trp被破壞，所以未能檢測到Trp。

2.4 螯合鐵的光譜分析

圖1 紫外光譜圖Fig.1 UV-VIS spectra

圖2 紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectrum

圖1顯示，短肽的特征吸收峰在273.8 nm，螯合鐵的最大吸收峰在332.2 nm，說明與亞鐵離子螯合后的短肽，其最大吸收峰發(fā)生紅移，且吸收強(qiáng)度增加。表明短肽與亞鐵離子作用后形成了新的物質(zhì)，其產(chǎn)生電子躍遷的能量與短肽的不同，因而其吸收光的波長不同[12]，這初步證實(shí)了短肽與亞鐵離子之間發(fā)生了螯合反應(yīng)。

圖2中發(fā)現(xiàn)，短肽由于氨基的伸縮振動、變角振動和羧基的伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰在與亞鐵離子螯合后，發(fā)生明顯的位移，其吸收強(qiáng)度也發(fā)生改變[13]。短肽在3290.45 cm-1處具有吸收峰，表明有-NH2存在；在1649.10 cm-1處具有吸收峰，說明有C=O的存在，而-COO-的吸收峰在1542.05 cm-1處；由NH3+變角振動引起的吸收峰在1078.18 cm-1處；由N-H的面外變形振動產(chǎn)生的吸收峰在542.94 cm-1處。短肽與亞鐵離子螯合后，氨基的吸收峰移動至3299.13 cm-1處，強(qiáng)度也發(fā)生改變；而C=O的吸收峰、-COO-的吸收峰分別移動至1651.97 cm-1、1534.32 cm-1；另外，NH3+變角振動引起的吸收峰以及由N-H的面外變形振動產(chǎn)生的吸收峰，螯合后分別移動至1039.60 cm-1、至595.98 cm-1處。這說明，與亞鐵離子發(fā)生配位的基團(tuán)可能是-NH2、C=O、-COO-、NH3+和N-H。

2.5 螯合鐵的微觀結(jié)構(gòu)

圖3 短肽和螯合鐵掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of short peptide and chelating iron

圖4 短肽和螯合鐵透射電鏡圖Fig.4 TEM images of short peptide and chelating iron

2 k和30 k倍數(shù)下的短肽電鏡圖（圖3）發(fā)現(xiàn)，短肽表面光滑，有均勻分布的裂紋，可能是短肽在電鏡真空環(huán)境下失水干燥留下的痕跡[14]。而2 k倍數(shù)下的螯合鐵電鏡圖中發(fā)現(xiàn)，螯合鐵表面不平整，有孔狀結(jié)構(gòu)，30 k倍數(shù)下的螯合鐵電鏡圖中發(fā)現(xiàn)螯合鐵顆粒是交織的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，可能是短肽與亞鐵離子反應(yīng)后，吸附了一定的鐵晶體[15]。

短肽與螯合鐵的透射電鏡圖（圖4）發(fā)現(xiàn)，短肽呈圓球狀，聚集在一起，分散比較均勻；而螯合鐵也呈圓球狀，聚集更加密集，但邊界分布不清，較模糊，分散不均勻。這說明，短肽與亞鐵離子螯合后，短肽與亞鐵離子結(jié)合更加緊密，聚集度更高。

3 結(jié)論

3.1 目前，關(guān)于螯合物的研究有很多，螯合工藝條件很成熟，蔡冰娜等[16]通過響應(yīng)面法優(yōu)化鱈魚皮膠原蛋白肽與氯化亞鐵的螯合工藝，得到螯合率為37.31%的鱈魚皮膠原蛋白肽螯合鐵；林慧敏等[17]采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化了復(fù)合酶解帶魚下腳料蛋白制備亞鐵螯合多肽的工藝，得到螯合率為82.31%的帶魚下腳料蛋白肽螯合鐵。但是以烏鱧為原料制備烏鱧短肽螯合物的研究鮮有報(bào)道。本研究選用烏鱧魚肉為原料，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，得到烏鱧短肽螯合鐵的最優(yōu)方案：以35000 U/g的加酶量加入胰蛋白酶得到短肽，再以質(zhì)量比為3:1加入短肽和氯化壓鐵，于pH 6.0的條件下，40 ℃水浴螯合30 min，在此條件下制備烏鱧短肽螯合鐵螯合率為84.46%。

3.2 通過對短肽和螯合物結(jié)構(gòu)的分析比較，不僅證實(shí)了短肽與金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)，還解決了螯合物的化學(xué)鍵問題，并分析了螯合物的反應(yīng)基團(tuán)[18]。本研究中通過對螯合前后氨基酸組分分析，發(fā)現(xiàn)螯合鐵中Asp和Glu含量較短肽增加，說明Asp和Glu的側(cè)鏈基團(tuán)上的羧基是短肽與亞鐵離子的結(jié)合位點(diǎn)。螯合前后的光譜分析發(fā)現(xiàn)，短肽的特征吸收峰的強(qiáng)度和位置都發(fā)生偏移，說明短肽的-NH2、C=O、-COO-、NH3+和N-H等基團(tuán)與亞鐵離子發(fā)生配位反應(yīng)。掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡則揭示了短肽與螯合物的微觀結(jié)構(gòu)，表明短肽與亞鐵離子之間還存在吸附作用，并且結(jié)合緊密。

3.3 本研究初步探究了烏鱧短肽與亞鐵離子的螯合工藝，并分析了螯合物的結(jié)構(gòu)特征。但是，關(guān)于短肽鐵螯合物的生物活性、構(gòu)效關(guān)系等還需要進(jìn)一步的探究。另外，短肽鐵螯合物作為新型的亞鐵離子補(bǔ)充劑，其吸收特性、安全性和穩(wěn)定性等也需要進(jìn)一步深入探究。

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