陳晨，張巖，李永波，李鵬，李永艷，張濤，張薇，周巍，張志勝

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定 071000）（2.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北石家莊 050071）（3.32142部隊廚師培訓中心，河北保定 071000）

隨著我國經(jīng)濟高速發(fā)展，不同肉類價格差異，使“摻雜使假”成為食品加工、流通和餐飲中存在的重要問題[1]。一些不法商販用一些廉價肉冒充高價肉進行出售，這對于市場的監(jiān)管是不利，這需要有關部門建立相關的檢測方法。PCR技術是檢測動物源性成分中發(fā)展較為完善、靈敏度及準確度都相對較好的技術手段[2,3]。用現(xiàn)有常見的熒光PCR進行檢測不能區(qū)分是故意摻假還是加工過程中無意的帶入，這就給監(jiān)管部門帶來了一定的困難，需要可靠的定量技術作為依托。

熒光PCR鑒別動物源性成分，一般根據(jù)線粒體進行特異性引物的設計。線粒體基因進化速度快，物種的區(qū)分度高，在科研上宜為物種分類的靶基因[4～8]。但不同物種中線粒體的拷貝數(shù)不同，對于物種的定量具有局限性。與線粒體相比，看家基因?qū)儆趩慰截惢?，有利于量化分析[9]。王珊等[10]建立了一種定量檢測羊肉制品中羊源性成分與豬源性成分的方法。René等[3]開始探索定量分析食品中的動物源性成份的技術方法，利用單拷貝基因設計引物，進行熒光PCR檢測，可以達到定量的檢測。宋麗萍等[11]根據(jù)豬的單拷貝基因β-actin和綿羊的單拷貝基因催乳素受體所設計的特異性引物，對于豬和羊的定量檢測取得了滿意的效果。

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)提出至今已有20年時間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學領域的一項關鍵技術和常規(guī)技術，極大地推動了生命科學各個領域的發(fā)展[12]。dPCR構想最早于1992年由Sykes等[13]基于樣品稀釋和泊松分布數(shù)據(jù)處理的巢式PCR定量技術而提出。20世紀末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR( digital PCR，dPCR)的概念[14]。微滴式數(shù)字PCR方法與實時熒光PCR方法相比較，無需標準曲線，下限可調(diào)至單拷貝，陽性微滴計算直接且準確[15,16]。本方法無需依靠標準曲線或參照基因，可直接得出DNA拷貝數(shù)，是對起始樣品的絕對定量[17]。因此該技術廣泛應用于物種鑒定[18]、病原檢測[19]、轉(zhuǎn)基因[20,21]及肉源成分檢測[22,23]及基因表達分析[24]等，該方法具有實用性強的應用前景。

本文在前人的基礎上初步探討了羊肉、豬肉及肉制品中動物源性成分的定量分析，采用羊肉和豬肉的精瘦肉作為研究的樣本，以基因組中單拷貝基因為靶基因設計引物和探針，采用微滴式數(shù)字PCR技術，建立動物源成分中羊肉和豬肉的定量分析，有利于市場的監(jiān)管。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮羊肉、牛肉、豬肉、雞肉和鴨肉等肉樣均為精瘦肉，羊肉卷、羊肉片、羊肉串、豬肉松、火腿腸、培根切片、煙熏肘花等羊肉和豬肉制品，均購于石家莊各大超市；引物及探針，由上海生物工程技術有限公司合成。

蛋白酶K(目錄號：DP304)，天根公司；Bio-Rad QX200 ddPCR微滴生成儀，美國Bio-Rad公司；ME204/02，電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NanoDrop 2000微量核算蛋白測定儀，美國Thermo公司；C1000 Touch Thermal Cycler基因擴增儀，美國伯樂公司；Sigma 1-15pk冷凍離心機，德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

取新鮮的肉樣、市售樣品用組織絞肉機進行絞碎于鼓風干燥箱中80 ℃、72 h烘干，用組織破碎機及液氮進行破碎處理研磨成超細的粉末，此肉樣用作實驗的樣品、摻假模型的建立及實際檢測，處理過程中不同肉樣分開處理，防止交叉污染。摻假模型及市售樣品的檢測稱取質(zhì)量均為100 mg。

1.2.2 DNA的提取

實驗中分別稱取10～100 mg肉樣，所有樣品均加入1000 μL組織細胞裂解緩沖液和150 μL蛋白酶k，渦旋振蕩，混勻，65 ℃水浴振蕩3 h；之后加入體積各半的苯酚、氯仿，混勻，12000 r/min離心10 min；將上層清液轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，加入與上層清液等體積的氯仿，混勻，12000 r/min離心5 min；再將上層清液轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，重復上一步驟；加入兩倍體積的冰乙醇(100%)和十分之一體積的3 M的乙酸鈉，混勻，并在-20 ℃下過夜處理；然后在12000 r/min下離心30 min，去上清，用75%的乙醇洗滌沉淀兩次，12000 r/min離心5 min，去上清，將沉淀物室溫風干，重懸于無菌的100 μL ddH2O中，并儲存在-20 ℃。以上所有離心過程均在4 ℃下進行。

1.2.3 樣品中羊、豬源性成分的檢測

羊源性和豬源性成分的引物和探針序列分別參考宋麗萍[11]和René K?ppel[3]合成，具體的引物和探針序列見表1。

1.2.4 微滴式數(shù)字PCR反應體系

ddPCR TM Supermix for Probes（No dUTP）10 μL，上下游引物各1.2 μL（900 nmol/L），探針0.4 μL（250 nmol/L），DNA模板4 μL，用雙蒸水補齊至20 μL。進行微滴化處理，之后進行普通PCR反應。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min，98 ℃10 min，40個循環(huán)。最后用微滴分析器對微滴進行分析。

1.2.5 羊肉和豬肉的質(zhì)量與拷貝數(shù)換算公式的確定

1.2.5.1 肉樣本質(zhì)量與DNA含量的關系

用精密天平準確稱取10 mg～100 mg的樣品，提取基因組DNA，并用Nanodrop2000進行DNA濃度的測定，每個質(zhì)量的肉樣設置三個重復。

表1 實驗所用的引物和探針列表Table 1 The list of primers and probes used in the experiments

1.2.5.2 肉樣本DNA含量與拷貝數(shù)的關系

分別對提取的羊肉和豬肉DNA進行9個和10個梯度的稀釋，羊肉為5、10、20、30、40、50、60、70、80 ng/μL，豬肉為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 ng/μL，進行ddPCR的的檢測，每個梯度設置三個重復。

1.2.6 已知混合肉樣的檢測

為驗證該方法準確性，對已知摻假比例的肉樣進行檢測(羊肉和豬肉的摻假比例為9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9)，總質(zhì)量為100 mg，按1.2.2的方法進行DNA的提取，對提取的DNA稀釋30倍，進行ddPCR的檢測。

1.2.7 對市售樣品的檢測

為進一步驗證數(shù)字PCR在肉類摻假中的實際應用能力，對在超市購買的預包裝羊肉串、散裝羊肉串、預包裝羊肉片、預包裝羊肉卷、散裝羊肉卷等羊肉制品和培根切片、醬熏肘花、肉灌腸、煙熏火腿、豬肉鋪等豬肉制品進行檢測。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，利用Excel進行圖表編輯

圖1 羊源性和豬源性引物和探針體系的特異性檢測Fig.1 The specificity detections of mutton and pork primer-probe systems

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測

本實驗在單拷貝上設計引物，為驗證引物的特異性，分別用牛、羊、豬、雞和鴨等進行特異性檢測，以無菌雙蒸水作為空白對照，如圖1所示，結(jié)果顯示羊源性引物和豬源性引物的特異性良好，能用于豬肉摻羊肉的摻假模型的檢測。

2.2 羊肉和豬肉DNA的提取率

圖2 羊肉質(zhì)量和DNA濃度的關系Fig.2 Linear relationship between meat quantity and DNA concnetration of mutton

為減少實驗誤差，本實驗采用精瘦肉進行摻假模型的制備，對不同質(zhì)量梯度的肉樣(10～100 mg)進行DNA的提取，并用Nanodrop 2000對提取的DNA的濃度進行測定，每個質(zhì)量三個重復，結(jié)果顯示生肉的質(zhì)量和DNA的濃度呈一定的線性關系，羊肉和豬肉的相關性系數(shù)R2均為0.9989。

該實驗表明羊肉和豬肉的生肉質(zhì)量和提取的DNA的濃度均呈明顯的線性關系。

圖3 豬肉質(zhì)量和DNA濃度的關系Fig.3 Linear relationship between meat quantity and DNA concentration of pork

2.3 DNA含量和拷貝數(shù)的關系

圖4 羊肉DNA濃度和DNA拷貝數(shù)之間的關系Fig.4 Linear relationship between DNA concentration and DNA copy number of mutton

將羊和豬提取的基因組DNA進行稀釋，羊的稀釋濃度為5～80 ng/μL，豬的稀釋濃度為20～200 ng/μL，取4 μL稀釋后的DNA進行數(shù)字PCR的檢測，結(jié)果顯示隨著DNA濃度的增加，DNA的拷貝數(shù)也增加，成一定的線性關系，羊和豬的相關性系數(shù)分別為R2=0.9986和0.9984，每個梯度重復三次。

2.4 羊肉和豬肉質(zhì)量與拷貝數(shù)關系的確定

根據(jù)生肉質(zhì)量和DNA濃度、DNA濃度和DNA拷貝數(shù)呈一定的線性關系，以DNA濃度為中間換算值，得到生肉質(zhì)量和DNA拷貝數(shù)的計算公式，羊的計算公式M羊=0.12C-10.6，豬的計算公式M豬=0.07C+4，其中，C指每微升的拷貝數(shù)（copies/μL），M指肉樣的質(zhì)量（mg）。

圖5 豬肉DNA濃度和DNA拷貝數(shù)之間的關系Fig.5 Linear relationship between DNA concentration and DNA copy number of pork

2.5 已知肉樣質(zhì)量的檢測

為驗證建立的ddPCR方法的準確性，本實驗對已知摻假比例的肉樣進行DNA的提取，對提取的DNA進行30倍的稀釋，取4 μL進行實驗，將實驗得到的拷貝數(shù)帶入生肉質(zhì)量和拷貝數(shù)的計算公式中計算得出生肉的質(zhì)量。實驗表明，測量值和實際值相差不大，可以作為實際市售樣品的檢測提供依據(jù)。表2即是已知摻假比例的肉樣的檢測結(jié)果。

2.6 市售樣品的檢測

通過對市售樣品的檢測，驗證本實驗ddPCR方法的準確性和實用性。由于目前市場上肉制品種類眾多，魚龍混雜，單從感官上無法識別肉制品的真實性，更無法識別肉制品是蓄意摻假還是無意識的污染，本實驗從定量的角度來判別肉制品的摻假問題，彌補了普通PCR和熒光PCR的不足。

本實驗針對所建立物種羊和豬的肉制品進行檢測，經(jīng)實驗所得市售羊和豬的樣品均存在一定的摻假現(xiàn)象，結(jié)果如表3所示，市售的羊肉制品標簽上并未顯示含有其它物種的肉。經(jīng)ddPCR測定后羊肉的含量最高是56%，最低為43.4%，所測樣品結(jié)果大概在50%左右。豬肉制品所含的實際含量就更少了，最高含量在36.69%，最低為5.25%。這表明了現(xiàn)有的市售樣品都存在一定的摻假情況，本實驗從定量的角度區(qū)別了摻假的程度，建立羊肉和豬肉檢測體系的實際應用能力。

表2 已知摻假比例的模擬混合樣品的ddPCR的定量分析Table 2 Quantitative analysis of ddPCR in simulated mixed samples of known adulteration ratio

表3 市售樣品ddPCR的定量分析Table 3 Quantitative analysis of samplesin local supermarket

3 結(jié)論

現(xiàn)在普通PCR研究肉類摻假已不能滿足要求，定量研究肉源性成分，解決目前市場上對肉類摻假問題的監(jiān)管和控制，是目前研究的熱點。

3.1 數(shù)字PCR建立了肉類摻假的定量分析，給肉制品市場監(jiān)管提供了有效的方法，該技術不依靠標準曲線和內(nèi)參基因，而是通過DNA的濃度作為中間換算值，建立生肉質(zhì)量和拷貝數(shù)的關系，通過拷貝數(shù)直接推算出生肉的質(zhì)量。王珊等[10]主要做了熒光PCR和數(shù)字PCR的方法比較，具有一定的意義，本文針對數(shù)字PCR對肉類摻假的檢測進行了更為細致的研究。數(shù)字PCR對肉類摻假的檢測方法比普通和熒光PCR的方法更方便和快捷，用時短，且能很好的解決在肉類流通過程中是人為因素的摻假還是無意的沾染，提高了工作的效率。

3.2 為驗證ddPCR方法的準確性，本實驗進行了已知質(zhì)量的肉類的摻假檢測，實驗結(jié)果表明實際值和測得的理論值相差不大，說明該方法的實際應用能力較強，市場應用潛力較大。

3.3 為更加貼合實際，本實驗還采取了市售樣品的檢測，由于市售肉及肉制品成分復雜多樣，肉品種類復雜，通過建立的ddPCR的方法能特異性的對羊肉和豬肉進行檢測。發(fā)現(xiàn)某些品牌的羊肉制品未標明摻假，但實際含量卻都在50%左右，均與標簽不符；所選的幾項豬肉制品，豬肉含量最高者為36.69%，最低含量為5.25%，實際豬肉的含量都不到總量的一半。說明現(xiàn)在市場上摻假現(xiàn)象還是嚴重的。該方法的建立能快速準確的對市場上用廉價肉代替高價肉的現(xiàn)象進行檢測。綜上所述，數(shù)字PCR快速、便捷具有一定的抗干擾能力，滿足了絕對定量的要求。目前市場肉制品的混亂，宗教和民族信仰的問題，數(shù)字PCR方法的建立為市場監(jiān)管，打擊不法商販，維護民族宗教信仰等問題上開辟了一條新的途徑，維護了消費者的權益。

[1] 李家鵬,喬曉玲,田寒友,等.食品和飼料中動物源性成分檢測技術研究進展[J].食品科學,2011,32(9):340 -347

LI Jia-peng, QIAO Xiao-ling, TIAN Han-you, et al.Advances in the detection of animal derived components in food and feed [J]. Food Science, 2011, 32(9): 340 -347

[2] 趙新,王勇,蘭青闊,等.熒光定量PCR方法鑒別肉制品中羊源性成分[J].食品工業(yè)科技,2015,36(1):299-302

ZHAO Xin, WANG Yong, LAN Qing-kuo, et al.Identification of sheep derived components in meat products by fluorescent quantitative PCR [J]. Science and Technology of Food Industry, 2015, 36(1): 299-302

[3] Koppel R, Jurg R, Jurg R. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef, pork, horse and sheep [J]. European Food Research and Technology,2011, 232(6): 151-155

[4] Pray-grant M G, Daniel J A, Schieltz D, et al. Chd1 chromodomain links histone H3 methylation with SAGA-and SLIK-dependent acetylation [J]. Nature, 2005, 433(7024):434-438

[5] Guo J, Guo A. Crossmodal interactions between olfactory and visual learning in Drosophila [J]. Science, 2005,309(5732): 307-310

[6] Elias M, Hill R I, Willmott K R, et al. Limited performance of DNA barcoding in a diverse community of tropical butterflies [J]. Proc. Biol. Sci., 2007, 274(1627): 2881-2889

[7] Vences M, Thomas M, Bonett R M, et al. Deciphering amphibian diversity through DNA barcoding: chances and challenges [J]. Philos. Trans. R Soc. Lond B. Biol. Sci., 2005,360(1462): 1859-1868

[8] Armstrong K F, Ball S L. DNA barcodes for biosecurity:invasive species identification [J]. Philos. Trans. R Soc. Lond.B Biol. Sci., 2005, 360(1462): 1813-1823

[9] Rodriguez M A, Garcia T, Gonzalez L, et al. TaqMan real-time PCR for the detection and quantitation of pork in meat mixtures [J]. Meat Sci., 2005, 70(1): 113-120

[10] 王珊,李志娟,苗麗.微滴式數(shù)字PCR與實時熒光PCR檢測羊肉制品中羊源和豬源性成分方法的比較[J].肉類工業(yè),2015,7:38-41

WANG Shan, LI Zhi-juan, MIAO Li. Comparison of microsphere digital PCR and real-time fluorescence PCR for detection mutton-derived and porcine-derived ingredients in mutton products [J]. Meat Industry, 2015, 7: 38-41

[11] 宋麗萍,薛晨玉,路勇,等.應用實時熒光PCR技術定量檢測羊肉中的豬肉成分[J].食品科技,2014,39(10):319-322

SONG Li-ping, XUE Chen-yu, LU Yong, et al. Detection and quantification pork in sheep products using real-time PCR [J].Food Science and Technology, 2014, 39(10): 319-322

[12] 黃留玉.PCR最新技術原理、方法及應用(第二版)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2011

HUANG Liu-yu. The new pcr technology, principle and application, 2nd ed [M]. Beijing: Chemical Industry Press,2011

[13] Sykes P J, Neoh S H, Brisco M J, et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution [J]. Biotechniques, 1992,13(3): 444-449

[14] Vogelstein B, Kinzler K W. Digital PCR [J] Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1999, 96: 9236-9241

[15] Hindson C M, Chevillet J R, Briggs H A, et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR [J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 1003-1005

[16] Sanders R, Huggett J F, Bushell C A, et al. Evaluation of digital PCR for absolute DNA quantification [J]. Analytical Chemistry,2011, 83(17): 6474-6484

[17] Sanders R, Huggett J F, Bushell C A, et al. Evaluation of digital PCR for absolute DNA quantification [J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(17): 6474-6484

[18] 胡偉,陳榮華,張晨,等.微滴式數(shù)字PCR技術用于生物樣品種屬鑒定和絕對定量[J].法醫(yī)學雜志,2014,30(5):342-345

HU Wei, CHEN Rong-hua, ZHANG Chen, et al. Species identification and absolute quantification of biological samples by droplet digital PCR [J]. Journal of Forensic Medicine, 2014, 30(5): 342-345

[19] 董蓮華,張玲,姜君,等.大腸桿菌O157:H7微滴數(shù)字PCR定量方法的建立[J].分析化學,2015,43(3):319-324

DONG Lian-hua, ZHANG Ling, JIANG Jun, et al.Development of droplet digital polymerase chain reaction for quantifying Escherichia Coli O157:H7 [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(3): 319-324

[20] Morisset D, Stebih D, Milavec M, et al. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR [J]. PLoS One, 2013, 8(5): 1-9

[21] 姜羽,胡佳瑩,楊立桃.利用微滴數(shù)字PCR分析轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報,2014, 22(10):1298-1305

JIANG Yu, HU Jia-ying, YANG Li-tao. Estimating the exogenous genes copy number of genetically modified organisms by droplet digital PCR [J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2014, 22(10): 1298-1305

[22] CAI Yi-cun, LI Xiang, Lü Rong, et al. Quantitative analysis of pork and chicken products by droplet digital PCR [J]. Bio.Med. Research International, 2014, 8: 1-6

[23] 朱鵬宇.利用微滴數(shù)字PCR定量檢測食品或飼料樣品[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報,2013,12:1-6

ZHU Peng-yu. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR [J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2013, 12: 1-6

[24] Brunetto G S, Massoud R, Leibovitch E C, et al. Digital droplet PCR(ddPCR)for the precise quantification of human T-lymphotropic virus 1 proviral loads in peripheral blood and cerebrospinal fluid of HAM/TSP patients and identification of viralmutations [J]. Journal of Neurovirology, 2014, 20(4):341-351