林曉 董文韜 賴霄晶 封巍 郁肖夫 谷慶 肖雯 鄭曉

[摘要] 目的 初步探究浙江地區(qū)晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的突變特征并為患者提供臨床靶向用藥理論依據(jù)。 方法 采用高通量測序技術，對79例浙江籍貫的NSCLC患者的ctDNA樣本進行基因靶向捕獲深度測序，對測序結果進行回顧性統(tǒng)計分析。 結果 EGFR基因的突變頻率最高，達到56.5%，發(fā)現(xiàn)的高頻突變還包括存在于TP53（33.3%）、KRAS（30.4%）、ERBB2（23.2%）、FGFR1（18.8%）、PTEN（15.9%）等基因的致病位點。EGFR突變更容易出現(xiàn)在女性、不吸煙、肺腺癌患者（P<0.05），KRAS突變更容易出現(xiàn)在年輕、吸煙患者（P<0.05），ERBB2突變?nèi)菀壮霈F(xiàn)在不吸煙的患者（P<0.05）。在44例（44/79，55.7%）中共發(fā)現(xiàn)了存在于8個基因的29個靶向用藥位點突變，在22例（22/44，50.0%）中檢測到同時存在多個用藥位點的現(xiàn)象，9例以往接受過酪氨酸激酶抑制劑藥物治療的復發(fā)患者均檢測到T790M突變。結論 NSCLC具有十分復雜的突變特征，基于ctDNA的高通量測序在一定程度上可以較全面反映腫瘤的分子特征，為患者提供更多的靶向用藥指導。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌;循環(huán)腫瘤DNA;高通量測序;基因突變

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）35-0026-06

[Abstract] Objective To investigate the mutation characteristics of circulating tumor DNA（ctDNA） in patients with advanced non-small cell lung cancer（NSCLC） in Zhejiang， and to provide theoretical basis for clinical targeted drug use. Methods High-throughput sequencing technology was used for targeted capture and deep sequencing of the ctDNA samples of 79 patients with NSCLC in Zhejiang， and the sequencing results were retrospectively analyzed. Results The mutation frequency of EGFR gene was the highest， reaching 56.5%. The high frequency mutations included sites on TP53 （33.3%）， KRAS （30.4%）， ERBB2 （23.2%）， FGFR1 （18.8%）， PTEN （15.9%）， etc. The EGFR mutations were more likely to occur in women， non-smokers， and patients with lung adenocarcinoma（P<0.05）. The KRAS mutations were more likely to occur in young patients and smokers（P<0.05）. The ERBB2 mutations were more likely to occur in non-smokers （P<0.05）. In 44 cases （44/79， 55.7%）， 29 targeted drug site mutations were found in 8 genes， and multiple drug sites were detected in 22 cases（22/44， 50.0%）. The T790M mutation was detected in 9 relapsed patients who had previously received tyrosine kinase inhibitor therapy. Conclusion NSCLC has very complex mutation characteristics. High-throughput sequencing based on ctDNA can reflect the molecular characteristics of tumors to a certain extent， and provide more targeted drug guidance for patients.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Circulating tumor DNA; High-throughput sequencing; Gene mutation

肺癌已成為我國發(fā)病率與死亡率均為第一高的惡性腫瘤，根據(jù)病理類型肺癌分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC），其中NSCLC占80%～85%[1]。近年來隨著癌癥基因組學與轉(zhuǎn)化醫(yī)學的快速發(fā)展，從分子層面上對NSCLC進行早篩、監(jiān)測、治療、預后的研究取得了許多重大突破，在最新的美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡指南與中國肺癌診療專家共識中，都建議將以肺癌驅(qū)動基因檢測為基礎的分子病理分型，作為肺癌治療及用藥的臨床依據(jù)[2]。目前組織樣本的檢測結果仍為基因特征判定的金標準，但組織樣本的獲取難度高、患者痛苦大、無法連續(xù)取樣、無法克服腫瘤異質(zhì)性等問題一直困擾著研究人員與臨床醫(yī)生[3]。

基于現(xiàn)有的研究成果，以循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測為代表的液態(tài)活檢是未來有望代替甚至超越組織樣本分子檢測的技術手段[4]。ctDNA是來源于腫瘤細胞的DNA片段，其主要存在于癌癥患者的外周血中，具有易獲取、可連續(xù)取樣等特點。CtDNA可能來源于任一腫瘤細胞，所以在反映腫瘤細胞突變特征的同時，可以一定程度上克服腫瘤的異質(zhì)性，且血液中ctDNA的半衰期在16 min～2.5 h，可以更“及時”地反映腫瘤狀態(tài)[5-7]。

血漿游離DNA（cell free DNA，cfDNA）在血液中的含量為（1.0～10）ng/mL，通常情況下ctDNA僅占cfDNA的0.1%～1%，且在腫瘤早期階段ctDNA的含量會更低[8]，在現(xiàn)有的高靈敏度分子檢測方法中，ARMS法[9]、ddPCR法[10]等只能檢測已知的單分子突變類型，而高通量測序法則可以在檢測多分子突變的同時，發(fā)現(xiàn)新的突變類型，非常適用于精準醫(yī)學的研究，但成本較前兩者稍高[11]。

目前對于NSCLC的分子研究大多聚焦于某個或某幾個驅(qū)動基因，這在一定程度上可能會限制新成果的發(fā)現(xiàn)，此次研究采用高通量測序技術對79例浙江地區(qū)NSCLC患者進行基因靶捕獲深度測序，在探究浙江地區(qū)NSCLC分子突變特征、總結基因突變與臨床病理關系的同時，為篩選分子靶向治療目標人群提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年6月～2018年5月浙江省腫瘤醫(yī)院79例NSCLC患者的血液樣本，所有入組患者籍貫均隸屬浙江省。男44例，女35例，中位年齡62歲，所有患者經(jīng)組織病理學確診為NSCLC，其中肺腺癌64例，肺鱗癌15例，UICC第8版TNM分期顯示ⅢB期10例，Ⅳ期69例，有吸煙史23例，初治21例，有直系親屬癌癥家族史9例。所有患者均簽署書面知情同意書，本研究已通過浙江省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本采集與DNA提取? 使用Streck采血管采集每位入組患者10 mL外周血，輕柔顛倒10次后于6℃～35℃保存，2 d內(nèi)進行DNA提取實驗。DNA提取試劑盒DNeasy Blood kit（德國Qiagen公司）用于提取血液樣本DNA，實驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行。利用Nanodrop檢測DNA的純度、電泳分析DNA的降解程度、Qubit精確定量DNA的濃度，所有檢測均合格的DNA樣品用于后續(xù)建庫實驗，不合格樣本需重新抽提DNA或重新采樣。

1.2.2 文庫構建及靶向捕獲測序? 建庫過程采用KAPA Hyper prep kit二代測序文庫構建試劑盒（美國Illumina公司），將片段化的DNA雙端末端修復，并添加dAMP到DNA片段的3端，之后片段兩端分別連接上包含barcode信息的接頭，完成文庫制備，經(jīng)PCR反應擴增文庫。采用靶向捕獲panel（包含78個檢測基因）進行目標 DNA文庫的高效富集（有10例患者只進行7個驅(qū)動基因的檢測），檢測文庫的質(zhì)量達到標準后，利用Illumina NextSeq CN500平臺進行PE150測序（高通量雙端測序），平均測序深度17640×。

1.2.3 生物信息學分析? 使用質(zhì)控軟件FastQC對下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)檢，質(zhì)量不合格的樣本需重新進行實驗，使用序列比對軟件BWA將測序結果比對到人類參考基因組（hg19），使用GATK進行序列比對優(yōu)化，Samtools軟件進行相關格式轉(zhuǎn)化，使用Varscan2和Speedseq進行基因SNV和InDel變異檢測，用ANNOVAR軟件對其進行變異注釋。結果經(jīng)Cosmic、dbSNP數(shù)據(jù)庫過濾后，去掉同義突變，選取突變豐度大于0.1%的變異為最終檢測結果。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，突變基因與臨床資料關聯(lián)分析采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者ctDNA突變特征分析

遵從患者意愿，在79例入組患者中，10例患者接受了7基因panel的檢測，69例患者接受了78基因panel的檢測（表1）。在69例患者78基因的檢測結果中，對突變頻率前30位的基因進行突變頻譜分析。結果顯示，基因EGFR突變頻率最高，達到56.5%（39/69），TP53、KRAS這兩種NSCLC常見突變的突變頻率分別為33.3%（23/69）、30.4%（21/69），此外，還發(fā)現(xiàn)存在于ERBB2（23.2%，16/69）、FGFR1（18.8%，13/69）、PTEN（15.9%，11/69）、BRAF（14.5%，10/69）等基因的致病突變。

EGFR基因的突變多發(fā)生于18～21號外顯子之間（94.9%，37/39），其中L858R占28.2%（11/39），19號外顯子缺失占20.5%（8/39），T790M耐藥突變占20.5%（8/39）。在14例患者中（35.9%，14/39）發(fā)現(xiàn)EGFR雙突變現(xiàn)象，3例患者（7.7%，3/39）發(fā)現(xiàn)三突變，1例患者發(fā)現(xiàn)EGFR（AS1）-ARHGAP10融合突變。KRAS基因的突變位點多集中于2號外顯子（95.2%，20/21），其中發(fā)生在12、13號密碼子的突變占90.0%（18/20）。在BRAF基因發(fā)生突變的患者中，發(fā)現(xiàn)2例（20.0%，2/10）V600E突變，其他變異均為V600附近點突變，如p.L597P、p.K601I、p.G606E等。此外，在7位（10.1%，7/69）患者中發(fā)現(xiàn)了基因融合現(xiàn)象，發(fā)生的基因有ALK、RET、KDR、ABL1等，但并沒有發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合突變。

2.2驅(qū)動基因突變與臨床特征的關系

匯總了79例患者的7個驅(qū)動基因（ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、MET、NRAS）突變信息，并將突變情況與臨床資料（性別、年齡、疾病分期、分型、吸煙史、治療史、直系親屬患癌史）進行關聯(lián)分析，結果表明EGFR、KRAS、ERBB2三個基因與某些臨床特征具有顯著相關性（表2）。EGFR基因突變的患者中，女性陽性突變率為80.0%（28/35），高于男性40.9%（18/44），腺癌64.1%（41/64）高于鱗癌33.3%（5/15），無吸煙史83.3%（30/36）高于有吸煙史37.2%（16/43），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;KRAS基因突變的患者中，年齡<60歲和≥60歲的陽性突變頻率分別為46.7%（14/30）及22.4%（11/49），有吸煙史和無吸煙史的突變頻率分別為41.9%（18/43）及19.4%（7/36），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;在ERBB2基因突變的患者中，無吸煙史患者則比有吸煙史患者有著更高的基因突變頻率，分別為33.3%（12/36）及14.0%（6/43），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 靶向治療用藥位點

研究中進一步對79例晚期NSCLC患者基因檢測結果中的靶向用藥位點進行統(tǒng)計，位點均為FDA批準用于癌癥靶向治療的靶點。結果表明，在44例（55.7%，44/79）中共發(fā)現(xiàn)了存在于8個基因的29個靶向用藥位點突變，其中頻率最高的存在于27例（34.2%，27/79）中的EGFR用藥突變（包括18外顯子G719S、19外顯子缺失、20外顯子T790M、21外顯子L858R），在14例患者（17.7%，14/79）中發(fā)現(xiàn)ERBB2用藥突變，其他基因還包括BRAF（V600E）、CDKN2A、KIT、MAP2K1、PDGFRA、PIK3CA。在22例（50.0%，22/44）中檢測到同時存在多個用藥位點的現(xiàn)象，對于患者來說更多用藥位點的發(fā)現(xiàn)代表著更多治療策略的選擇，這對控制疾病進展及應對耐藥發(fā)生具有實際意義。檢測到9例患者存在經(jīng)典的靶向藥物耐藥突變EGFR（T790M），對比治療記錄后發(fā)現(xiàn)，這9例患者以往均接受過酪氨酸激酶抑制劑類藥物治療且目前疾病復發(fā)，提示在臨床可以根據(jù)患者基因特征對預后進行一定的評估。

3 討論

越來越多的研究顯示，對于NSCLC患者尤其是晚期患者，精準靶向用藥相較于放化療可以更大程度延長患者生命，利用基因檢測技術探究患者靶向用藥的突變基因，現(xiàn)已成為NSCLC臨床治療的常用手段[12-14]。目前普遍將組織學樣本作為檢測的金標準，但組織樣本除取樣過程復雜、創(chuàng)傷較大、無法連續(xù)取樣等缺點外，對于某些體質(zhì)較差或腫瘤生長位置危險的患者來說，難以通過手術或穿刺取得組織樣本[15]，這些因素制約了基因檢測在NSCLC中的應用。本研究中以患者ctDNA為樣本，利用高通量測序技術探究浙江地區(qū)晚期NSCLC突變特征，同時為患者靶向用藥做出指導。

以往關于NSCLC的研究結果顯示，EGFR突變頻率為40%左右[16]，KRAS突變頻率約為20%[17]，F(xiàn)GFR1、ERBB2、BRAF突變頻率為5%左右[18-20]，且NSCLC的基因突變往往具有一定人群特征性，如EGFR在非亞裔人群中的突變頻率為10%～20%，KRAS在黃種人中的突變頻率為5%～10%，在白種人中為20%[21，22]，MET在歐美人群中突變頻率為3%～4%[23]等。此次研究中所檢測到的基因突變頻率略高于以往研究，推測可能的原因有：首先，研究中的入組人群均為晚期NSCLC患者，突變種類及數(shù)目較中早期多;其次，研究中采用高質(zhì)量的ctDNA樣本，一定程度上可以克服腫瘤的異質(zhì)性;第三，大部分患者均發(fā)生了不同程度的轉(zhuǎn)移，所以ctDNA不僅來源于原發(fā)灶，也會來自轉(zhuǎn)移灶;第四，實驗中所用捕獲探針覆蓋區(qū)域較廣，可以發(fā)現(xiàn)基因更多位點的突變;第五，實驗中采用了深度測序（平均測序深度17640×），且突變豐度截斷值設置較低（實驗中為0.1%，類似實驗中為0.2%～0.5%），可以發(fā)現(xiàn)更多的低頻突變;最后，研究中患者均為浙江地區(qū)人群，可能有一定的人群特征性。

在7個驅(qū)動基因與臨床資料的關聯(lián)分析中，EGFR基因突變常發(fā)生于女性、不吸煙、肺腺癌患者（P<0.05），這與以往的亞洲人群肺癌研究相符[24]，而吸煙對KRAS基因與ERBB2基因突變的影響在以往研究中有不同的結論。此次研究中發(fā)現(xiàn)，在18例ERBB2突變的患者中，17例患者均為肺腺癌，腺癌與鱗癌ERBB2陽性突變率分別為26.6%（17/64）與6.7%（1/15），提示ERBB2的突變可能與肺腺癌的發(fā)生相關，但由于樣本量的限制，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.19）。類似的情況也發(fā)生在ERBB2與家族史的關聯(lián)分析中，接近一半有直系親屬患癌史的患者存在ERBB2突變，陽性突變率為44.4%（4/9），而在無家族史的患者中陽性突變率僅為20.0%（14/70），提示ERBB2基因的突變可能存在一定的遺傳性，但是需要開展更大規(guī)模的研究（P=0.22）。

隨著ctDNA相關檢測技術的不斷發(fā)展，ctDNA在NSCLC精準用藥指導中體現(xiàn)出了越來越高的應用價值，在許多臨床研究中ctDNA檢測發(fā)現(xiàn)了組織檢測未發(fā)現(xiàn)的用藥位點突變，從而改善了患者的治療結局，并且與NSCLC患者常規(guī)進行的驅(qū)動基因檢測相比，基于高通量測序的大panel檢測可以發(fā)現(xiàn)更多靶向用藥位點。此次研究中除發(fā)現(xiàn)了NSCLC多個驅(qū)動基因的突變外，還發(fā)現(xiàn)了FGFR1、PTEN、PDGFRA、PIK3CA、MAP2K1、CDKN2A等許多NSCLC相關突變及用藥位點，這使得我們可以更全面、更精準地掌握疾病分子特征，一方面為晚期NSCLC患者提供更多的藥物選擇及耐藥應對策略，同時也提供了從分子層面進行NSCLC早篩、監(jiān)測、耐藥等研究的理論基礎。

綜上所述，晚期NSCLC患者中基因突變的數(shù)目及頻率相對較高，采用高通量測序進行較大panel的檢測可以更全面了解腫瘤分子特征，這對個體患者疾病的認識及靶向用藥的選擇都具有重要的實際意義。此外，選取特定地區(qū)范圍人群可能會在一定程度上克服腫瘤異質(zhì)性，可對該地區(qū)患者的疾病進行更加精準的檢測與分析，給予針對性的特異治療，使療效最大化。

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（收稿日期：2018-09-10）