◎ 楊秀芬，陳澤宇

（1.保定圣德益眾生物科技有限公司，河北 保定 071000；2.衡水市第二中學(xué)，河北 衡水 053000）

目前，多使用靈芝的子實(shí)體和靈芝孢子粉入藥，發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲體，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，獲得菌絲體生物量不高，生產(chǎn)成本高，發(fā)酵難度大。本研究通過對(duì)紫芝單因子搖瓶試驗(yàn)獲得最佳培養(yǎng)參數(shù)，研究獲得菌絲體的方法，從而為進(jìn)一步深入研究靈芝菌絲體的藥理作用和工業(yè)化生產(chǎn)途徑做好前期研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紫靈芝[Ganoderma japonicum(Fries) Lloyd]，河北大學(xué)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

L3S型可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）、ZWY-2112D型旋轉(zhuǎn)式搖床（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）、BSC-250型培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、PHS-3C型pH計(jì)（上海優(yōu)科儀器儀表有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

蔗糖、葡萄糖（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、蛋白胨（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）、MgSO4·7H2O（天津市光晨科技發(fā)展公司）、KH2PO4（天津市科密歐化學(xué)試劑公司）、VB1（大同市云岡制藥廠）。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米粉2%，蔗糖2%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.005%。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

紫芝菌種經(jīng)過3次轉(zhuǎn)接活化后，分別對(duì)影響紫芝發(fā)酵的pH值、裝液量、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、發(fā)酵溫度和搖床轉(zhuǎn)速等因素，進(jìn)行單因子試驗(yàn)。以菌絲體干重和多糖含量為指標(biāo)，篩選出最佳培養(yǎng)條件[1]。

1.5 計(jì)算方法

（1）菌絲干質(zhì)量測(cè)定方法。取發(fā)酵液100 mL用80目的銅網(wǎng)過濾得菌絲體，用蒸餾水洗滌3次，置于65 ℃恒溫干燥箱中烘干，稱量其干重，計(jì)算公式為：

菌絲干質(zhì)量（mg·mL-1）=菌絲體干質(zhì)量（mg）÷發(fā)酵液體積（mL）。

（2）胞外多糖測(cè)定方法。采用濃硫酸-苯酚法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵最適pH的篩選

調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，接種量均為8%，裝液量為 150 mL，搖床培養(yǎng)（150 r·min-1，26 ℃）6 d后，收集菌絲，測(cè)定菌絲干質(zhì)量、胞外多糖產(chǎn)量，見表1。

表1 pH不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質(zhì)量含量表

由表1可以看出，pH為6.5較合適。

2.2 最適裝液量篩選

在500 mL的三角瓶中分別裝不同量發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為 8%，pH 6.5，搖床（150 r·min-1，29 ℃）培養(yǎng)5 d，測(cè)定生物量、菌絲多糖產(chǎn)量，結(jié)果見表2。

表2 裝液量不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質(zhì)量含量表

由表2得出，當(dāng)裝液量為150 mL時(shí)，生物量和胞外多糖含量都接近最高值。

2.3 最適接種量篩選

在500 mL三角瓶中裝150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.5，調(diào)節(jié)接種量，搖床（180 r·min-1，29 ℃）培養(yǎng)5 d，測(cè)定生物量、菌絲多糖產(chǎn)量，結(jié)果見表3。

表3 接種量不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質(zhì)量含量表

由表3得出，菌絲生物量在接種量為10%時(shí)最高。

2.4 最適培養(yǎng)時(shí)間篩選

在500 mL三角瓶中裝150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.5，接種量10%，搖床（150 r·min-1，29 ℃）培養(yǎng)不同天數(shù)，測(cè)定生物量、胞外多糖產(chǎn)量[2]，結(jié)果見表4。

表4 培養(yǎng)時(shí)間不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質(zhì)量含量表

結(jié)果得出，菌絲生物量在第5 d產(chǎn)量最高，菌絲生物量最高。

2.5 最適發(fā)酵溫度篩選

在500 mL三角瓶中裝150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.5，接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速180 r·min-1，在不同溫度下培養(yǎng)5 d，測(cè)定生物量，胞外多糖產(chǎn)量，結(jié)果見表5。

表5 發(fā)酵溫度不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質(zhì)量含量表

由表5得出，當(dāng)溫度為29 ℃時(shí)，菌絲的生物量和多糖產(chǎn)量都達(dá)到最高。

2.6 最適搖床轉(zhuǎn)速篩選

在500 mL三角瓶中裝150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，pH為6.5，接種量分別為10%，在29 ℃條件下實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間為5 d，測(cè)定生物量、胞外多糖產(chǎn)量，結(jié)果見表6[3]。

表6 轉(zhuǎn)速不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質(zhì)量含量表

由表6得出，轉(zhuǎn)速在180 r·min-1時(shí)，菌絲的生物量和多糖產(chǎn)量最高。

3 結(jié)論

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，得出了最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件：最佳發(fā)酵條件起始pH為6.5，裝液量150 mL，接種量10%，最佳發(fā)酵時(shí)間為5 d，最佳發(fā)酵溫度29 ℃，最佳搖床轉(zhuǎn)速在 160 r·min-1。