◎ 王子坤，賈清華，李雅雯，韓愛芝，黃 英，奚 倩，吳 鑫，侯旭杰

（1.塔里木大學(xué)分析測試中心，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；3.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

有機(jī)酸在整個葡萄酒的釀造過程起到十分重要的作用，有機(jī)酸的存在會改善葡萄酒的口感，但是含量要適中?？偹峥梢宰鳛楹饬科咸丫破焚|(zhì)的一個重要指標(biāo)，用pH值來表示，酸度值位于2.9～3.9。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及西方營養(yǎng)學(xué)的進(jìn)步，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)了葡萄酒中更多的特性以及獨(dú)特用處。葡萄酒中對人體有益的成分有上百種，包含有機(jī)酸類、酚類、維生素類，雖某些成分含量不高，但極易被人體的吸收利用。酒中的有機(jī)酸類物質(zhì)，能體現(xiàn)出葡萄原料的特征以及成品酒的風(fēng)味特點(diǎn)，也可以反映釀造工藝的特點(diǎn)。酒石酸又被稱為葡萄酸，化學(xué)名稱2,3-羥基丁二酸，成品酒中葡萄酸的含量為1.5～2.5 g·L-1，作為酒中含量比較高的一種酸，會對酒的顏色產(chǎn)生一定影響[1-4]。自然界水果中都存在蘋果酸，隨著酒釀造過程進(jìn)行，酒精發(fā)酵結(jié)束后便會進(jìn)入蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段。蘋乳發(fā)酵降低了生酒的生青味和酸澀度、粗糙度和色度等，使酒體更加柔和、圓潤。乳酸產(chǎn)生于葡萄酒發(fā)酵第二階段，它的濃度直接影響著pH值，在人體中也產(chǎn)生乳酸，但是濃度不會上升的太高。丙酮酸是一種重要的中間代謝產(chǎn)物，在糖酵解發(fā)生時磷酸烯醇丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下生成丙酮酸，對葡萄酒的口感影響較低，因?yàn)樵诎l(fā)酵過程被分解所以含量低。在植物動物體內(nèi)都有草酸的存在。植物中的草酸多以草酸鈣而存在，在成品酒中幾乎沒有，對口感沒有很大影響。甲酸酸性很強(qiáng)，可以刺激皮膚。乙酸、乙醇可以形成香味物質(zhì)乙酸乙酯，如果發(fā)酵后期沒有很好的隔絕空氣，或者有可能被雜菌感染，乙酸濃度增大，說明酒已經(jīng)變質(zhì)。琥珀酸又叫丁二酸，在酵母發(fā)酵的過程中，經(jīng)三羧酸循環(huán)均會代謝產(chǎn)生琥珀酸；蘋乳發(fā)酵形成琥珀酸；谷氨酸的轉(zhuǎn)化也形成琥珀酸[5-9]。葡萄果實(shí)中均含有檸檬酸。在TCA循環(huán)中檸檬酸僅是中間產(chǎn)物。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室自釀慕薩萊思在A（原汁）、B（濃縮）、C（陳釀）三個階段進(jìn)行采樣，成品酒（D）來自新疆阿瓦提刀郎慕薩萊思有限公司，阿瓦提慕薩萊思（葡萄）。

標(biāo)準(zhǔn)品：草酸、DL-酒石酸、甲酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、一水檸檬酸、D-蘋果酸、琥珀酸（Dr.Ehrenstorfer GmbH）。 丙 酮 酸 [Alfa Aesar（China）Chemicals Co. Ltd]，抗壞血酸（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑），十三烷酸甲酯（上海安譜）。標(biāo)準(zhǔn)品純度均在99%以上。

1.2 儀器設(shè)備

WATERS 2695高效液相色譜儀（美國Waters儀器公司），GL-20 G-2高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），BP211D電子分析天平（北京賽多利思有限公司），SB-25-12DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物公司），100～1 000 μL微量移液槍（上海安譜），Trace1300 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo公司），DB-5MS UI（30×0.250×0.25）氣相色譜柱（美國Agilent公司），N-1100-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、CCA-1111冷卻水循環(huán)裝置、DC-12H恒溫水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法[10-11]

1.3.1 定性分析

使用氣質(zhì)聯(lián)用儀自帶的譜庫進(jìn)行檢索，分析結(jié)果，參考文獻(xiàn)、查詢相關(guān)資料共同進(jìn)行定性。

（1）氣相色譜條件。DB-Wax毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 μm）；載氣He（99.999%）；恒流，柱流速1.0 mL·min-1；分流比25∶1；進(jìn)樣量2.0 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初溫40 ℃，保持2 min，以7 ℃·min-1升至 150 ℃，保持 5 min，再以 6 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min。

（2）質(zhì)譜條件。電子電離源：電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；傳輸管線溫度280 ℃；溶劑延遲時間3.5 min；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 29～500。

1.3.2 試劑準(zhǔn)備

利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將甲醇中的水分蒸干，溫度40 ℃，制成無水甲醇，將50 mL濃硫酸加入到350 mL的無水甲醇中，加入的同時冷水浴，并使用玻璃棒不斷攪拌。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將二氯甲烷中的水分蒸干，溫度35 ℃，制成無水CH2Cl2。

在標(biāo)準(zhǔn)天平室稱取標(biāo)準(zhǔn)品，稱取0.025 g十三烷酸甲酯，用甲醇溶解標(biāo)準(zhǔn)品，并用膠頭滴管定容至25 mL，得到1 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放于冰箱4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品前處理

取約40 g樣品加入250 mL三角瓶，加入1 mg·mL-1十三烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)儲備液500 μL，再加入60 mL 12.5%的硫酸-甲醇溶液，搖勻后放入于35 ℃培養(yǎng)箱，130 r·min-1，恒溫30 h。拿出反應(yīng)液然后倒入漏斗過濾，過濾完成后使用重蒸好的二氯甲烷60 mL進(jìn)行萃取，萃取完成加入飽和氯化鈉洗滌2次，洗滌完成加入10 g無水硫酸鈉，除去水分，然后密封置于-20 ℃冰箱靜置過夜。除去干燥劑后用高純度氮?dú)獯祾?，濃縮，液體轉(zhuǎn)移到5 mL容量瓶中，用重新蒸餾過的二氯甲烷溶液定容，取定容溶液2.0 μL進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.4 有機(jī)酸的HPLC定量分析

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取酒石酸、蘋果酸、一水檸檬酸、抗壞血酸、琥珀酸、草酸各0.05 g，用超濾水定容至5 mL；甲酸、乙酸、乳酸、丙酮酸各20 μL，定容至2 mL，濃度分別為10 mg·mL-1，此液為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別取標(biāo)準(zhǔn)使用液0.02、0.1、0.2、0.5 mL和1.0 mL，加入0.2 mL的1 mol·L-1的磷酸，用超濾水稀釋至10 mL，混勻。樣品上機(jī)體積10 μL，在210 nm位置處測量峰高或峰面積，有機(jī)酸的濃度大小作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰的峰面積作為縱坐標(biāo)，并且使用軟件做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.3.5 樣液的制備

將放在冰箱的樣品進(jìn)行解凍，取15～20 mL的樣品倒入離心管，設(shè)定離心機(jī)10 000 r·min-1時間5 min，拿出離心管得到上清液5 mL，小心轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的10 mL容量瓶，加入配制好的0.2 mL的磷酸溶液（1 mol·L-1），稀釋至10 mL使用超純水，濾膜使用0.45 μm過濾，得到濾液以便供分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

樣品經(jīng)過甲酯化衍生以后，二氯甲烷作為溶劑而后進(jìn)行萃取，萃取液經(jīng)過濃縮，然后用GC-MS儀器進(jìn)行定性分析，得到GC-MS總離子流圖，據(jù)質(zhì)譜總離子流圖，同時通過儀器自帶的數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行檢索，也可以人工手動解析，從而對目標(biāo)峰進(jìn)行定性，確定有機(jī)酸的種類。樣品中各個有機(jī)酸的種類、保留時間及相似度見表1，各階段GC-MS圖譜如圖1～3所示。

表1 樣品中各個有機(jī)酸的種類、保留時間及相似度表

圖1 原汁階段GC-MS圖譜圖

圖2 濃縮階段GC-MS圖譜圖

圖3 陳釀階段GC-MS圖譜圖

通過表1可以準(zhǔn)確地確定有機(jī)酸的種類，進(jìn)行比較準(zhǔn)確的定性，相關(guān)系數(shù)都達(dá)到了800以上，通過GC-MS進(jìn)行定性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 11種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為了更準(zhǔn)確的計(jì)算樣品中有機(jī)酸的含量，本試驗(yàn)采用外標(biāo)法對不同時間段樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行含量分析。繪制了各有機(jī)酸的峰面積-濃度曲線，計(jì)算11種有機(jī)酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并給出了其線性范圍，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)，如表2所示。

表2 11種有機(jī)酸的保留時間與線性回歸方程表

11種標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖4所示，通過色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，11種標(biāo)準(zhǔn)品可以很好地分離，所采用的色譜條件可以滿足樣品分析需要。

圖4 11種有機(jī)酸混標(biāo)色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的重現(xiàn)性分析

為了驗(yàn)證方法保留時間的重現(xiàn)性，對11種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了6次重現(xiàn)性試驗(yàn)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品6次保留時間（min），結(jié)果如表3所示。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

從表3得知，各種有機(jī)酸保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.021%～0.598%，說明儀器系統(tǒng)與實(shí)驗(yàn)方法可靠，樣品重現(xiàn)性好，可以滿足樣品分析需要。

2.4 HPLC法對樣品中有機(jī)酸含量的分析

樣品中的有機(jī)酸含量見表4。

表4 樣品中含有的有機(jī)酸含量表

通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)樣品未完全溶解時，樣品中的有機(jī)酸的含量會比完全溶解時的含量要多。所以，為得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要將樣品完全解凍，分析解凍后的樣品中所含有的有機(jī)酸的種類及其含量。薩萊思葡萄酒在濃縮階段，含有DL-酒石酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸、一水檸檬酸、琥珀酸。其中酒石酸的含量最大也是最穩(wěn)定的，而丙酮酸與琥珀酸只是在一個時間段檢測出，且含量還比較低，一水檸檬酸在濃縮期含量變大，隨后消失。D-蘋果酸隨著濃縮的時間越長，含量逐漸減小，而L-蘋果酸卻隨著濃縮時間越長，含量逐漸增大，但是D-蘋果酸與L-蘋果酸濃度之和在逐漸增大。在陳釀期時，琥珀酸沒有檢測出來，丙酮酸出現(xiàn)，L-蘋果酸，酒石酸含量降低、D-蘋果酸的含量大致沒有發(fā)生變化。在成品酒慕薩萊思中檢測出了4種有機(jī)酸，分別是DL-酒石酸、L-蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸。

3 結(jié)論

利用液相色譜儀對濃縮階段葡萄汁、慕薩萊思葡萄酒中有機(jī)酸進(jìn)行了分析，在濃縮葡萄汁階段，含有DL-酒石酸、DL-蘋果酸、一水檸檬酸、琥珀酸。在慕薩萊思葡萄酒中只檢測出了DL-酒石酸、L-蘋果酸、丙酮酸、琥珀酸。定量實(shí)驗(yàn)采用HPLC法、GC-MS法分析慕薩萊思在發(fā)酵及陳釀的不同時期，所含有的有機(jī)酸的種類。在實(shí)驗(yàn)階段優(yōu)化條件，條件最終確定為：色譜柱型號CNW Athena C18，（120 A，4.6×250 mm，5 μm），0.01 mol·L-1NaH2PO4（pH=2.7）為流動相條件，0.8 mL·min-1的流速，柱溫設(shè)定30 ℃，波長設(shè)定210 nm，進(jìn)樣體積10 μL，可以較好地分離和檢測自釀慕薩萊思葡萄酒在不同時期有機(jī)酸含量的變化。所建方法的RSD為0.210%～0.598%，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999。在GC-MS所分析出的有機(jī)酸的種類與HPLC中一部分酸有很大的差異，因?yàn)樵贖PLC中柱子的類型、儀器靈敏度、流動相pH值等都會對結(jié)果產(chǎn)生影響，最主要是因?yàn)闃悠烦煞诌^于復(fù)雜導(dǎo)致樣品色譜峰無法很好地分離，所以有機(jī)酸種類的確定主要以GC-MS分析結(jié)果為判定依據(jù)，通過圖譜庫確認(rèn)結(jié)果比較準(zhǔn)確，HPLC僅僅通過出峰時間來進(jìn)行定性是不夠準(zhǔn)確的尤其是成分比較復(fù)雜的情況下。通過對有機(jī)酸的變化進(jìn)行檢測，通過成分分析，可以對實(shí)際生產(chǎn)進(jìn)行指導(dǎo)，未來可以對其變化機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步的分析。