施煜 鄭增堯 黃文水 鄭曼冰

【摘 要】建立高效液相色譜-原子熒光光譜法（HPLC-AFS）測(cè)定護(hù)膚膏酸中4 種砷形態(tài)[亞砷酸鹽As（Ⅲ）、砷酸鹽As（Ⅴ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）]的方法。樣品用硝酸溶液超聲提取后，用Hamilton PRP-X100陰離子交換柱分離，以15mmol/L磷酸氫二胺溶液為流動(dòng)相，等度洗脫，后經(jīng)原子熒光測(cè)定各組分含量。優(yōu)化后原子熒光的條件：硼氫化鉀濃度為20g/L（含5g/L NaOH），載流為體積分?jǐn)?shù) 5%的鹽酸。方法的線性范圍為0～100μg/L，線性相關(guān)系數(shù)大于0.9990，4 種砷形態(tài)的檢出限為0.025～0.029μg/L，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～3.0%（n=7），加標(biāo)回收率為86.0%～100.8%。該方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確、靈敏，檢測(cè)成本低，可用于護(hù)膚膏酸砷形態(tài)的檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜-原子熒光光譜法；護(hù)膚膏酸；砷形態(tài)

中圖分類號(hào)： O657；TS254.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2018）32-0140-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.32.064

0 前言

砷是國(guó)際公認(rèn)最具潛在危害性的重金屬元素之一，是常見的、已知的、對(duì)人體健康傷害非常嚴(yán)重的一種污染物。砷毒性取決于其賦存形態(tài)，常見的砷化合物包括亞砷酸鹽As（Ⅲ）、砷酸鹽As（Ⅴ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）、砷甜菜堿、砷膽堿、砷糖等。其中無機(jī)砷毒性大于有機(jī)砷毒性，As（Ⅲ）>As（Ⅴ）>MMA>DMA，砷膽堿和砷甜菜堿普遍被認(rèn)為是無毒的[1，2]。

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）對(duì)職業(yè)接觸者的研究表明，暴露于無機(jī)砷，對(duì)人具有致癌性，皮膚可吸收砷而引起皮炎、色素沉積等到皮膚病，最終引起肺、膀胱和皮膚癌[3]。我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中規(guī)定砷的限量為10mg/kg。護(hù)膚膏酸中的砷主要來源于制造用水、無機(jī)礦物質(zhì)、植物及海洋生物提取物和防腐劑等，As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA和DMA是其主要存在的毒性砷形態(tài)化合物[4]。因此化妝品中砷對(duì)人體的危害不能簡(jiǎn)單用總量來評(píng)估，其形態(tài)分析更科學(xué)準(zhǔn)確。

目前，報(bào)道砷形態(tài)分析方法主要有高效液相色譜-原子熒光法（ HPLC-AFS）[4-6]、樹脂分離-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]、毛細(xì)管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜[9]、高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜法（HPLC-ICP-MS）[11]等。其中毛細(xì)管電泳法靈敏度偏低，需通過修飾或進(jìn)樣技術(shù)等方式提高靈敏度，對(duì)操作要求較高；ICP-MS儀器較昂貴，維護(hù)費(fèi)用高，不適合一般實(shí)驗(yàn)室，且存在同量異位素、多原子分子離子以及多電荷離子的干擾問題。故選用了高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用法，利用高效液相色譜對(duì)護(hù)膚乳酸中不同形態(tài)的砷進(jìn)行分離，用原子熒光儀進(jìn)行定量，同時(shí)測(cè)定樣品亞砷酸、砷酸、甲基砷酸、二甲基砷酸的方法，該方法具有檢出限低、準(zhǔn)確度和精密度高、檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

PF52型原子熒光形態(tài)分析儀；BS224S型電子天平；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；Vortex-Genie2漩渦混合器；5860A超聲波脫氣儀；PHS-3C型酸度計(jì)；Milli-Q Advantage超純水機(jī)型；BIO-DL Colour移液器（20-200ul）；

標(biāo)準(zhǔn)溶液：GBW 08666亞砷酸根As（Ⅲ）溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，GBW 08667砷酸根As（Ⅴ）溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，一甲基砷（MMA）溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，二甲基砷（DMA）溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

試劑：磷酸二氫胺（分析純）、硼氫化鉀（分析純）、氫氧化鉀（分析純）、甲酸（分析純）、硝酸（分析純）、鹽酸（分析純）、氨水（分析純）、正己烷（分析純）、冰乙酸（分析純）。

1.2 樣品提取

稱量1.0 g左右樣品，精確到0.001g，置于50mL具塞離心管中。加入15.0mL硝酸溶液（0.15mol/L），渦旋混勻，于60℃超聲提取90min，冷卻至室溫，4℃冰箱中放置10min后，以8000r/min4℃離心15min，取上清液，過0.45μm濾膜備用。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1000μg/L砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用移液槍分別吸取20μL As（Ⅲ）、86μL As（Ⅴ）、60μL MMA、28μL DMA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，用高純水定容至1.5mL；

100μg/L砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取1.0mL1000μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用高純水定容至10mL；

分別吸取上述砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用超純水稀釋定容，配成0，5.0，10.0，20.0，30.0，50.0μg/L的系列砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，即配即用。

1.4 色譜條件

色譜柱：Hamilton PRP-X100陰離子交換柱；流動(dòng)相：15mmol/L磷酸氫二胺溶液，用甲酸（10%）調(diào)節(jié)pH=6.0；等度洗脫；流速：1.0mL/min；柱溫：常溫；閥控制：常規(guī)流路；進(jìn)樣體積：100μL。

1.5 熒光檢測(cè)條件

負(fù)高壓：300V；主燈電流：50mA；爐溫：200℃；爐高：8mm；主氣流量：300mL/min；輔助氣流量：600mL/min；還原劑：20g/L硼氫化鉀溶液-5g/L氫氧化鈉溶液；載液：5%鹽酸溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

護(hù)膚膏酸中含有乳化劑，易在提取過程中使溶液形成乳濁液，選擇用0.15mol/L硝酸溶液于60℃進(jìn)行超聲提取，考察了超聲提取30，60，90，120min對(duì)砷提取效率的影響。結(jié)果表明，4種砷形態(tài)的提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)提取時(shí)間為90min時(shí)，提取率達(dá)到最大；當(dāng)提取時(shí)間大于90min時(shí)，提取率有下降的趨勢(shì)，可能是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)而導(dǎo)致一部分砷損失。故試驗(yàn)選擇提取時(shí)間為90min。

2.2 色譜流動(dòng)相pH值的選擇

流動(dòng)相的pH值對(duì)分離效果有較大影響，試驗(yàn)考察了在15mmol/L磷酸氫二胺溶液中滴加甲酸或氨水調(diào)pH至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，對(duì)20μg/L的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，當(dāng)pH=6.0時(shí)，4種砷形態(tài)可以得到較好分離，故試驗(yàn)選擇流動(dòng)相pH為6.0。

2.3 載流鹽酸濃度的選擇

配制5種體積分?jǐn)?shù)不同的鹽酸溶液（1%，5%，10%，15%，20%），對(duì)20μg/L的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，隨著鹽酸體積分?jǐn)?shù)的增大，砷的熒光信號(hào)值逐漸增大；當(dāng)鹽酸的體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，砷形態(tài)的熒光信號(hào)響應(yīng)值最大，效果最好，故選擇載流鹽酸的體積分?jǐn)?shù)為5%。

2.4 還原劑硼氫化鉀濃度的選擇

硼氫化鉀是氫化物發(fā)生反應(yīng)的還原劑，其濃度直接影響砷氫化物的發(fā)生效率，試驗(yàn)考察了硼氫化鉀溶液的質(zhì)量濃度在5～50g/L之間時(shí)對(duì)測(cè)定砷各形態(tài)化合物色譜峰面積的影響。結(jié)果表明：當(dāng)硼氫化鉀溶液質(zhì)量濃度在5～20g/L時(shí)，砷各形態(tài)化合物色譜峰面積隨濃度升高而升高；但隨硼氫化鉀溶液質(zhì)量濃度的升高，當(dāng)濃度大于20g/L時(shí)，反應(yīng)過于激烈并產(chǎn)生大量泡沫，影響氣液分離，導(dǎo)致噪聲增大，重現(xiàn)性差，而且高濃度的硼氫化鉀不及時(shí)沖洗容易結(jié)晶使儀器管道堵塞。故試驗(yàn)選擇硼氫化鉀溶液質(zhì)量濃度為20g/L。為防止硼氫化鉀分解，加入5g/L氫氧化鈉溶液。

2.5 色譜圖

在1.5、1.6儀器工作條件下對(duì)100μg/L的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)試，色譜圖見圖1。由圖1可見，在12min之內(nèi)，亞砷酸鹽、二甲基砷酸、一甲基砷酸、砷酸鹽依次出峰，實(shí)現(xiàn)了完全分離，其保留時(shí)間分別為2.650，3.650，5.050，10.183min。

2.6 方法的線性及檢出限

配制濃度為0，10，20，40，80，100μg/L的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.5、1.6儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，每種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣為100μL，以各待測(cè)物的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同時(shí)進(jìn)行20次試劑空白試驗(yàn)，按照公式：C=3sb/b（C為方法的測(cè)定低限；s為空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差；b為方法校準(zhǔn)曲線的斜率）計(jì)算各待測(cè)物檢出限。

4種砷形態(tài)化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。由表1可知，在0～100.0ng/mL范圍內(nèi)4種砷形態(tài)化合物質(zhì)量濃度與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均≥0.9990。亞砷酸根、二甲基砷檢出限為0.029μg/L，一甲基砷、砷酸根檢出限為0.025μg/L。

2.7 精密度試驗(yàn)

在不含待測(cè)物的空白護(hù)膚膏酸中，加入20μg/kg的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.3的分析方法進(jìn)行前處理，在1.5、1.6的儀器工作條件下平行測(cè)定7次，結(jié)果見表2。由表2可知，亞砷酸根，二甲基砷，一甲基砷，砷酸根測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.4%，2.2%，3.0%，2.5%，表明該方法的精密度較高。

2.8 回收率試驗(yàn)

在不含待測(cè)物的空白護(hù)膚膏酸中，分別加上3個(gè)水平的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3的分析方法進(jìn)行前處理，在1.5、1.6的儀器工作條件下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知，樣品的加標(biāo)回收率為86.0%～100.8%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)論

建立了利用HPLC-AFS同時(shí)測(cè)定護(hù)膚膏酸中亞砷酸根（AsⅢ）、砷酸根（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）的方法，該方法具有檢出限低，準(zhǔn)確度和精密度高，檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)，適用于護(hù)膚膏酸中亞砷酸根、砷酸根、一甲基砷酸和二甲基砷酸4種砷形態(tài)的測(cè)定。

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