◎ 韓秋紅，李 琴，李凱鋒

（1.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 150090；2.黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150087）

牛奶的組成接近于人體母乳，因此人體很容易消化和吸收牛奶的營(yíng)養(yǎng)成分。牛奶的營(yíng)養(yǎng)成分主要包括水分、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、礦物質(zhì)和維生素等[1]。牛奶良好的營(yíng)養(yǎng)也適宜微生物生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌屬在原料乳中污染最嚴(yán)重。芽孢是某些細(xì)菌在生長(zhǎng)發(fā)育后期，在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形或橢圓形的抗逆性休眠體[2]。農(nóng)場(chǎng)中的飼料、土壤和糞便等易受芽孢菌污染，牛舍周圍也廣泛存在芽孢菌[3]，這些菌易污染奶牛乳頭表面，使原料乳污染芽孢菌。當(dāng)原料奶中有較多的芽孢時(shí)，加工后貯存過(guò)程中芽孢轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)體，隨著貯存期的延長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)酸包、脹包現(xiàn)象[4]。作為乳與乳制品中的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，芽孢菌檢測(cè)十分重要。目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)乳與乳制品中芽孢菌的權(quán)威方法為農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1331-2007中第二部分需氧芽孢總數(shù)測(cè)定方法，本文對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行解讀并重點(diǎn)分析檢測(cè)的注意事項(xiàng)。

1 檢測(cè)原理

利用微生物能夠生長(zhǎng)和繁殖的特性，使微生物由肉眼看不見(jiàn)的微小個(gè)體變?yōu)槿庋劭梢?jiàn)的菌落。

將樣品加熱處理以除去非芽孢菌，然后向樣液中加入能為芽孢菌提供豐富營(yíng)養(yǎng)的乳平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（MPC培養(yǎng)基），放入合適環(huán)境下培養(yǎng)，最后計(jì)數(shù)。

2 稀釋液和培養(yǎng)基的作用與使用要求

（1）蛋白胨-鹽溶液各組分作用。酶水解酪蛋白胨既為芽孢菌提供氮源，又為其提供生長(zhǎng)因子；氯化鈉能平衡芽孢菌的滲透壓。

（2）磷酸鹽緩沖液的作用。磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)鹽平衡，還可緩沖調(diào)整液體pH。

（3）MPC培養(yǎng)基各組分作用。酵母浸膏可給芽孢菌提供豐富的B族維生素；胰蛋白胨既是芽孢菌中氮的來(lái)源，又是芽孢菌中碳的來(lái)源；葡萄糖是芽孢菌的能源物質(zhì)；脫脂奶粉使整個(gè)培養(yǎng)基體系更接近乳制品，還原芽孢菌的生長(zhǎng)環(huán)境。

（4）MPC培養(yǎng)基使用要求。①若滅菌后馬上使用，則滅菌后將其冷卻后放入45 ℃水浴中。②滅菌后需要貯存，則將其冷藏存放于暗處，存儲(chǔ)時(shí)間應(yīng)小于30 d。③若使用前加熱融化培養(yǎng)基，則將融化好的培養(yǎng)基放于水浴中，水溫為45 ℃。

3 設(shè)備、材料及注意事項(xiàng)

①微生物實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備和材料及（36±1）℃培養(yǎng)箱、（45±1）℃和（80±1）℃水浴鍋，無(wú)菌的培養(yǎng)皿、吸管（或移液器及槍頭）以及試管。②應(yīng)注意培養(yǎng)皿等物品的清潔無(wú)菌狀態(tài)，且不含有抑菌的任何成分。③推薦使用微量移液器及吸頭，若使用吸管則不允許用嘴去吸吸管。④應(yīng)注意使用的微量移液器是否可高壓滅菌，是否檢定或校準(zhǔn)。⑤培養(yǎng)箱及計(jì)量設(shè)備應(yīng)按規(guī)定做檢定或校準(zhǔn)及進(jìn)行期間核查，注意利用并及時(shí)更新修正因子。

4 具體操作及注意事項(xiàng)

4.1 檢樣處理及注意事項(xiàng)

4.1.1 檢樣處理

稱取固態(tài)樣品10 g（或25 g），加入90 mL（或225 mL）稀釋液（蛋白胨-鹽溶液或磷酸鹽緩沖液）中混勻，制成10-1的初級(jí)稀釋液。

4.1.2 注意事項(xiàng)

①注意對(duì)樣品外包裝處理的要求，保證樣品外包裝進(jìn)入無(wú)菌室前清潔。②注意樣品混勻（“三個(gè)混勻”之一），如混勻液體樣品可將其翻轉(zhuǎn)25次，避免形成泡沫。③注意稱樣要準(zhǔn)確。④注意溶解固體樣品的稀釋液應(yīng)預(yù)熱至45 ℃。⑤注意樣品與稀釋液要混勻（“三個(gè)混勻”之二）。若手動(dòng)振搖稀釋液，應(yīng)保證液體在7 s內(nèi)以30 cm振幅進(jìn)行25次往返振搖。

4.2 加熱處理及注意事項(xiàng)

4.2.1 加熱處理

準(zhǔn)備好（80±1）℃水浴，將5～10 mL液體樣品，或5～10 mL固態(tài)樣品初級(jí)稀釋液，放入滅菌后的試管中。把試管立刻放入水浴加熱10 min，取出立刻冷卻于低于20 ℃的流水中。

4.2.2 注意事項(xiàng)

①向試管中加樣液不得碰觸超出水浴水面的試管內(nèi)壁，也不得碰觸水面以下2 cm以內(nèi)的試管內(nèi)壁。②吸樣量要準(zhǔn)確。③吸液時(shí)，不同規(guī)格的吸頭浸入液面的合適深度不同。使用規(guī)格為200 μL～2 mL的吸頭浸入液面深度應(yīng)為3～6 mm；使用規(guī)格為大于2 mL的吸頭浸入液面深度應(yīng)為6～10 mm，吸液后吸頭要停留在液面下1 s?？刂苿蛩傥阂苑乐箮霘忪F污染樣品、液體沖入移液器套柄損傷密封圈和活塞以及吸液過(guò)程形成氣泡。④水浴中的水面應(yīng)比試管內(nèi)樣液面至少高出4 cm。⑤每次檢測(cè)準(zhǔn)備一個(gè)對(duì)照管，向?qū)φ展苤形肽虡雍蠓乓恢囟扔?jì)，以測(cè)定奶溫。⑥試管內(nèi)樣液應(yīng)在5 min內(nèi)完成升溫。

4.3 進(jìn)一步稀釋液的制備及注意事項(xiàng)

取1 mL熱處理冷卻后的樣液，加入裝有9 mL稀釋液的試管中搖勻，得到10倍稀釋樣液。如此再做稀釋，每次遞增10倍。

注意事項(xiàng)：①吸取每一稀釋度樣液，應(yīng)使用單獨(dú)的吸管或吸頭。②應(yīng)保證稀釋液滅菌后的準(zhǔn)確體積。③將樣液轉(zhuǎn)入稀釋液試管時(shí)，吸管或吸頭頂端不可碰觸稀釋液面。

4.4 接種和培養(yǎng)及注意事項(xiàng)

4.4.1 接種和培養(yǎng)

樣液培養(yǎng)后計(jì)數(shù)有10～150個(gè)菌落認(rèn)為是選擇了合適的稀釋度。做遞增10倍稀釋的同時(shí)，取該合適稀釋度液體兩個(gè)1 mL加入兩個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)。立刻向培養(yǎng)皿中傾倒MPC瓊脂12～15 mL混勻。同時(shí)做空白試驗(yàn)（加入1 mL稀釋液和培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中混勻）。培養(yǎng)基凝固后倒置，于（36±1）℃堆疊培養(yǎng)皿培養(yǎng)（48±2）h。

4.4.2 注意事項(xiàng)

①可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)或產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)限量值選擇合適的稀釋度。②傾倒培養(yǎng)基時(shí)保證所用的培養(yǎng)基溫度約45 ℃。溫度過(guò)高，會(huì)在平板蓋上聚集水蒸氣，如不及時(shí)翻轉(zhuǎn)平板，凝結(jié)的水蒸氣落入瓊脂，造成菌落游走或擴(kuò)散（有可能長(zhǎng)成整個(gè)平板是一個(gè)大片菌），使計(jì)數(shù)困難，甚至菌與菌相互污染。培養(yǎng)基溫度過(guò)低會(huì)變?yōu)楣腆w或半固體狀態(tài)，影響培養(yǎng)基與樣品均勻混合。③加入樣液后及時(shí)向培養(yǎng)皿中傾注培養(yǎng)基。傾注培養(yǎng)基后不要急于封蓋。④樣液與培養(yǎng)基要混勻（“三個(gè)混勻”之三）。應(yīng)關(guān)注培養(yǎng)基與樣液的混勻程度，混合時(shí)平板可按前后左右、順時(shí)針、逆時(shí)針等方向分別晃動(dòng)，直至沒(méi)有明顯的白色底及白色云狀物。⑤傾倒培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿并混合均勻后應(yīng)水平放置待其凝固。⑥培養(yǎng)基凝固后立即倒置平板。⑦限制操作時(shí)間。應(yīng)在15 min內(nèi)完成從熱處理結(jié)束到傾注培養(yǎng)基混勻的操作。⑧可用空培養(yǎng)皿加入培養(yǎng)基作對(duì)照試驗(yàn)，以檢查操作過(guò)程中的無(wú)菌性?？瞻缀蛯?duì)照試驗(yàn)培養(yǎng)后應(yīng)均無(wú)菌落生長(zhǎng)。⑨為防止菌落蔓延可在培養(yǎng)基凝固后再次加入一薄層培養(yǎng)基，或培養(yǎng)皿上蓋里放一張有少許甘油的濾紙。⑩培養(yǎng)時(shí)間的一致性，培養(yǎng)溫度的均勻性，培養(yǎng)箱放置位置要使其外壁避開(kāi)陽(yáng)光直射；培養(yǎng)箱內(nèi)物品避免填充過(guò)滿，保證培養(yǎng)箱內(nèi)空氣流通，培養(yǎng)皿與培養(yǎng)箱內(nèi)壁距離≥25 mm，培養(yǎng)皿疊放在培養(yǎng)箱內(nèi)每疊≤6個(gè)，各疊培養(yǎng)皿間距離≥25 mm。

4.5 菌落計(jì)數(shù)及注意事項(xiàng)

4.5.1 菌落計(jì)數(shù)

肉眼對(duì)培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)菌落數(shù)，必要時(shí)可借助放大鏡。蔓延的菌落計(jì)做一個(gè)菌落，若菌落蔓延部分大于培養(yǎng)皿底部的1/4則不應(yīng)計(jì)數(shù)，若菌落蔓延部分比培養(yǎng)皿底部的1/4小，則計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中無(wú)蔓延菌落部分后，按比例計(jì)算出整個(gè)培養(yǎng)皿的相對(duì)結(jié)果。

4.5.2 注意事項(xiàng)

①計(jì)數(shù)時(shí)不要將極微小的菌落遺漏。②應(yīng)識(shí)別出多個(gè)混合的菌落。③應(yīng)識(shí)別培養(yǎng)皿上的氣泡和樣品等的雜質(zhì)。④當(dāng)培養(yǎng)皿上出現(xiàn)菌落間呈鏈狀生長(zhǎng)，且沒(méi)有明顯界線，應(yīng)將一條單鏈作為一個(gè)菌落。⑤蔓延的菌落可能是爬行或菌落鏈、瓊脂表面水膜和皿底水膜。

5 計(jì)算結(jié)果及注意事項(xiàng)

保留的培養(yǎng)皿應(yīng)含有10～150個(gè)菌落，計(jì)算后保留兩位有效數(shù)字。樣品中需氧芽孢總數(shù)[CFU/mL（g）]＝保留培養(yǎng)皿中菌落計(jì)數(shù)總和÷（保留的第一個(gè)稀釋度的培養(yǎng)皿個(gè)數(shù)+0.1×保留的第二個(gè)稀釋度的培養(yǎng)皿個(gè)數(shù)）×保留的第一個(gè)稀釋度的稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：①計(jì)算結(jié)果以整數(shù)計(jì)，修約原則為“四舍五入”法。結(jié)果既可以用10的指數(shù)報(bào)告，也可以取前兩位有效數(shù)字后，用0來(lái)補(bǔ)位。②若每個(gè)稀釋度培養(yǎng)皿中菌落數(shù)均為＜10，則以“＜10×最低稀釋度的稀釋倍數(shù)CFU/mL（g）”計(jì)。③若每個(gè)稀釋度培養(yǎng)皿中都有150個(gè)以上菌落數(shù)，則以“＞150×最高稀釋度的稀釋倍數(shù)CFU/mL（g）”計(jì)。④注意培養(yǎng)皿菌落計(jì)數(shù)結(jié)果偏差。本人重復(fù)計(jì)數(shù)結(jié)果偏差應(yīng)≤8%，雙人計(jì)數(shù)結(jié)果偏差應(yīng)≤10%。常見(jiàn)的不符合原因有：視力疲勞、注意力不集中、未充分辨認(rèn)菌落，可通過(guò)避免長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)、養(yǎng)成專心習(xí)慣、借助放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)等方法，使菌落計(jì)數(shù)更加準(zhǔn)確。

6 檢畢物品的廢棄注意事項(xiàng)

①計(jì)數(shù)后的平皿應(yīng)使用高壓滅菌容器將其滅菌處理后，才能洗刷。②報(bào)告檢測(cè)結(jié)果后，才能處理檢樣。

7 總結(jié)

芽孢菌檢測(cè)的每一步操作過(guò)程都要密切注意無(wú)菌操作。①應(yīng)注意檢測(cè)中使用的培養(yǎng)皿等物品的清潔無(wú)菌狀態(tài)，且不含有抑菌的任何成分。②注意培養(yǎng)基配制中其成分的有效性。③注意使用的微量移液器是否可高壓滅菌，是否檢定或校準(zhǔn)。④注意樣品要混勻、樣品與稀釋液要混勻、樣液與培養(yǎng)基要混勻。⑤應(yīng)在15 min內(nèi)完成從熱處理結(jié)束到傾注培養(yǎng)基混勻的操作。正確規(guī)范地對(duì)芽孢菌進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)乳制品質(zhì)量準(zhǔn)確評(píng)估，為我國(guó)乳與乳產(chǎn)品的健康保駕護(hù)航。