張敏李倩

(皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院急診科,安徽蕪湖241001)

膿毒癥 (sepsis)的最新國際共識是指宿主對感染的失控反應,并引起嚴重危及生命的器官功能障礙[1-2]。在感染或可疑感染的基礎上對ICU和非ICU患者給出了不同的診斷標準。ICU患者序貫器官功能衰竭評分 (SOFA)≥2分,非ICU患者快速序貫器官功能衰竭評分 (qSOFA)符合2項及以上時即可診斷為膿毒癥[2]801-810。因其具有多病因、多影響因素、發(fā)病機制復雜等特點,治療上一直沒有突破性的進展。分子水平研究給膿毒癥的治療和預后評估帶來了新方向。本文重點綜述膿毒癥生物分子水平的最新研究成果。

1 膿毒癥與DNA

血漿游離DNA(cfDNA)是存在于血液、腦脊液等體液中片段化、具有較低分子量的DNA,由凋亡細胞、壞死細胞釋放而來。正常情況下細胞凋亡釋放的cfDNA數小時內會被清除,因此正常人cfDNA在較低水平維持動態(tài)平衡。因為cfDNA的半衰期較短,我們可以將測得的數值作為經機體平衡后的實時含量。膿毒癥時,病原體入侵機體導致抗炎和促炎反應的失衡,多種炎癥介質的釋放相互作用形成網絡效應導致多系統(tǒng)多器官損傷。細胞被動裂解增多、cfDNA清除降低等使得cfDNA含量異常增高為其可能機制,且機體受損傷程度與其增高水平呈正相關。這不同于以往的監(jiān)測標記物如PCT、CPR等。它們主要反應促炎細胞因子水平、微生物產物水平[3],不能對膿毒癥患者做出準確的預后評估。因此cfDNA水平的監(jiān)測可能成為診斷和評估膿毒癥的一個可靠指標。由于膿毒癥沒有明顯的疾病前兆,而在膿毒癥發(fā)生的前6 h對患者采取積極的干預措施可以顯著降低患者病死率[4-5],因此這一監(jiān)測指標尤為重要。銀雪等[6]人對31例全身炎癥反應綜合征 (SIRS)和35例膿毒癥患者進行cfDNA含量監(jiān)測,并以17例健康者cfDNA含量作為對照樣本。研究發(fā)現對照組和SIRS組cf-DNA顯著低于膿毒癥組,入院時的SOFA評分與第1天cfDNA濃度呈正相關。經過進一步分析后,他們認為cfDNA的定量監(jiān)測可作為臨床治療效果和膿毒癥患者預后評估的指標。若以cfDNA濃度＞8 939 GE/mL作為診斷膿毒癥的截斷值,其特異性和敏感性分別為80.65%和77.14%。目前,國內外還沒有研究發(fā)現能對膿毒癥進行早期識別的高敏感性的特異性監(jiān)測指標。cfDNA對膿毒癥患者的臨床實用性和其預測價值仍有待進一步的研究。

2 膿毒癥與RNA

2.1 微小RNAs(microRNA)

microRNAs(miRNAs)是一類內源基因編碼的小RNA,可通過多種方式參與調控蛋白編碼基因的表達,約由22～27個核苷酸構成。據推測,人類約1/3的基因表達受到miRNAs的調控[7]。當病原微生物入侵機體后,宿主細胞會產生大量miRNAs參與機體固有免疫應答[8]。這為其治療提供了新思路。通過反轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)比較健康對照組和早期膿毒癥組血漿中miRNAs的表達量發(fā)現兩組間部分miRNAs存在明顯差異。這可能預示miRNAs會成為診斷膿毒癥的新近生物標記物。研究發(fā)現,多種信號通路如核因子κB(NF-κB)通路、Toll樣受體 (TLRs)信號途徑、JAK激酶/信號轉導和轉錄激活子 (JAK/STAT)通路等都參與了膿毒癥的病理過程。不同的JAK/STAT信號通路在膿毒癥的病理過程中介導不同的作用,其中JAK4/STAT6通路的激活可改善患者癥狀,降低病死率。miR-223可能通過調控START3通路從而調節(jié)IL-1β和IL-6介導的炎癥反應[9],在NF-κB通路中 miRNA-223參與對 IκB激酶 α(IKKα)的抑制從而減少了IL-12和IL-6的釋放,當細菌LPS入侵宿主細胞時,miRNA-233下調促進炎癥因子的釋放,參與早期促炎反應。有研究表明,相對于PCT、CRP,miRNA-233對膿毒癥的預測靈敏度最高[10]。當機體經TLRs信號途徑識別病原體后,可介導miRNA-146a的表達調節(jié)急性炎癥反應。適量釋放的促炎因子可促進中性粒細胞募集以清除細菌,miRNA-15a、miRNA-16的過度表達會抑制TLR4通路介導的促炎因子的釋放。有研究稱,與 CRP、PCT比較,miR-15a用于鑒別SIRS和膿毒癥具有更好的敏感性和特異性。

2.2 長鏈非編碼RNA(lncRNA)

多器官功能障礙是膿毒癥最新定義的重點指向。其中心功能障礙為膿毒癥患者最嚴重的并發(fā)癥之一,也是膿毒癥患者的主要死因之一。lncRNA是長度在200～100 000個核苷酸之間的非編碼RNA。以目前的研究成果,我們仍需加強對lncRNA的研討,臨床上在循環(huán)系統(tǒng)的運用主要集中在尋找特異性的lncRNA生物標記物和其作為潛在的藥物治療靶點。膿毒癥時促炎因子的分泌是心肌損傷的根本原因,有研究表明TNF-α是一種能夠引起心肌延展性和收縮峰值速率下降的促炎因子。lncRNA可通過間接調節(jié)細胞因子如IL-1β、TNF-α等從而調控心肌損傷。在對感染小鼠骨髓源性巨細胞的RNA研究中發(fā)現多種lncRNA表達水平增高,其中l(wèi)ncRNA-環(huán)氧化酶2(COX2)升高最明顯。lncRNA-COX2可通過調節(jié)TLR-NF-κB通道促進炎癥發(fā)展。Li等[11]研究發(fā)現,其他lncRNA如linc0206、linc 3995、linc7190和linc7705均參與了調節(jié)TNF-α或 IL-6的水平但其機制未知。另一方面,Ca2+濃度的變化不僅直接影響心肌興奮收縮耦聯(lián)還可以調節(jié)細胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放。在一定水平內的Ca2+濃度升高可以增加心肌收縮力,但若線粒體內Ca2+超載則會導致不可逆的損害甚至細胞死亡。在對果蠅的研究中發(fā)現[12],多種lncRNA通過肌質網的ATP酶參與調節(jié)Ca2+濃度從而調控心肌功能。然而在膿毒癥中,lncRNA通過何種方式調節(jié)心肌細胞尚需進一步研究。

3 膿毒癥與基因編碼的蛋白質

3.1 程序性死亡受體 (PD-1)

基因表達的完整性取決于轉錄、翻譯、蛋白質空間構象的改變等一系列過程,蛋白質是mRNA翻譯后的加工產物,那么對蛋白質進行人為的干預修飾會直接影響著基因的表達。隨著基因研究的不斷深入,人們逐漸意識到某些基因編碼的蛋白質經人為干預后可調節(jié)膿毒癥的炎癥反應。有動物實驗表明,在膿毒癥早期階段免疫系統(tǒng)即受到抑制[13]。這對預防組織過度炎癥反應極其重要。PD-1作為CD28超家族成員中一種重要的免疫抑制分子,可與B7家族中PD-L1結合。PD-L1主要表達于抗原呈遞細胞表面如樹突狀細胞、單核巨噬細胞等。當抗原呈遞細胞表面高表達PD-1時會出現免疫耐受,影響樹突狀細胞抗原呈遞能力,導致單核巨噬細胞吞噬能力降低等。有研究發(fā)現,在膿毒癥患者外周血中發(fā)現一類PD-L1+抑制表型中性粒細胞亞型,可通過細胞-細胞直接接觸方式抑制T細胞功能[14]。最新研究[15]認為PD-1/PD-L1可導致T細胞耗竭。PD-1與T細胞膜上PD-L1配體結合使T細胞呈無應答狀態(tài)和 (或)凋亡。有研究認為,中性粒細胞膜上高表達的PD-L1可以作為膿毒癥患者出現免疫抑制的更好的生物標記物[16]。自然殺傷細胞在機體抗腫瘤、抗感染和免疫調節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用,是機體重要的免疫細胞能夠識別靶細胞、釋放殺傷介質。有研究發(fā)現,在感染單純皰疹病毒后,患者自然殺傷細胞膜上出現PD-1高表達現象,而PD-1+NK細胞抗感染、抗腫瘤能力均顯著降低[17]。因此有學者認為PD-1/PD-L1可以決定膿毒癥患者免疫狀態(tài),是導致患者出現不同結局的關鍵因素?；蛟S可以通過調節(jié)PD-1/PDL1的表達來調控機體免疫平衡以改善膿毒癥患者預后水平。

3.2 高遷移率族蛋白Bl(HMGBl)

現階段臨床醫(yī)師在對膿毒癥患者進行治療時,主要的干預措施是早期的液體復蘇和控制感染,然而針對早期致炎因子如IL-1、TNF等的治療效果并不令人滿意。因為早期炎癥因子在炎癥反應開始數小時后就恢復到基礎水平而炎癥的損害卻一直持續(xù)。作為細胞核內非組蛋白的HMGB1是一種晚期促炎因子,具有3個獨特的結構域,分別為A-box、B-box和C-端。其中B-box是HMGB1發(fā)揮炎癥作用的功能區(qū),A-box是B-box的拮抗位點可作為潛在的 HMGB1的拮抗劑,C-端是調節(jié)HMGB1與 DNA相互作用的重要結構[18]。同時HMGB1自身也可作為促炎因子,在膿毒癥病理過程中與TNF-α、IL-1、IL-8等炎性因子在炎性反應通路上形成一個促炎的正反饋環(huán)路,通過破壞炎癥反應中促炎細胞因子和抵抗炎癥的抗炎細胞因子之間的動態(tài)平衡導致炎癥級聯(lián)信號放大。對小鼠膿毒癥的實驗中發(fā)現其HMGB1含量增加明顯且不管小鼠對LPS是否敏感,將重組HMGB1經腹腔注射到小鼠體內后,小鼠均死亡。因此推測HMGB1可能是導致小鼠死亡的直接原因而并非LPS。大量臨床研究中發(fā)現,膿毒癥病人的血清中HMGB1水平明顯高于正常人且其升高水平與APACHEⅡ評分、qSOFA評分對于膿毒癥患者評估的嚴重程度呈正相關。大多數膿毒癥患者住院7 d后其血清HMGB1濃度仍處于較高水平。在因膿毒癥死亡的患者中發(fā)現相對于其他炎癥因子如TNF、IL-8等血清HMGB1濃度高達數百倍,從而說明HMGB1水平與膿毒癥休克患者的病情進展及預后密切相關[19]。因此動態(tài)檢測HMGB1水平有助于對患者預后的評估和調整治療方案,同時也為膿毒癥的抗炎治療提供了一個更好的新靶向,具有重要的意義。

3.3 可溶性白細胞分化抗原14亞型 (sCD14-ST,即Presepsin)

CD14是存在于單核細胞和巨噬細胞表面的一種白細胞分化抗原,以膜結合 (mCD14)型和可溶性 (sCD14)兩種不同的形式存在于體內。sCD14是一種由348個氨基酸構成的糖蛋白,高達機體總CD14含量的99%。當機體發(fā)生感染時,mCD14或sCD14被血漿中激活的組織蛋白酶裂解后產生一種相對分子質量為13 000的片段即為sCD14-ST。Presepsin作為LPS結合蛋白的受體不僅可直接參與機體體液和細胞免疫反應,起到LPS信息呈遞作用來促進單核細胞分泌TNF-α等各種細胞因子介導一系列免疫炎癥反應,更重要的是促進LPS向脂蛋白轉移[20]并促進單核細胞、巨噬細胞吞噬脂多糖結合蛋白以清除細菌及內毒素。目前,PCT在膿毒癥患者的治療和預后評估[21]中具有較高的應用價值。有研究表明PCT在膿毒癥的診斷上的特異性和敏感性均高于Presepsin。Masson[22]等證明了Presepsin水平對膿毒癥患者的病情判斷及預后評估方面優(yōu)于PCT。然而Presepsin會受到如年齡、腎損傷等因素的影響,因此與其他生物分子聯(lián)合診斷可能是較好的解決方法[23]。以Presepsin作為診斷的截斷值設定還需要大樣本的研究提供依據。

4 結語與展望

在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中遺傳和環(huán)境是兩個重要的影響因素。臨床治療策略目前還沒有突破性進展,主要原因是其病理過程涉及到復雜的全身炎癥網絡效應、機體免疫功能和患者對病原體的易感性等多個方面且具體發(fā)病機制尚不明確。對于膿毒癥生物分子水平的研究仍在繼續(xù),無論是在轉錄水平、轉錄后水平還是在翻譯水平都取得了一定的成果。盡管目前CRP、PCT等在臨床上已經普遍應用于對膿毒癥患者的評估并指導臨床醫(yī)師的決策,但膿毒癥的發(fā)生率和病死率并沒有得到明顯改善。尋找具有高特異性和高敏感性的生物分子以區(qū)分是否因感染引起的全身炎癥反應相關的多器官功能障礙更具有挑戰(zhàn)性。隨著分子生物學的不斷發(fā)展,更多免疫學、基因學方面新的特異性標記物將被發(fā)現,彌補了單純炎癥標記物的不足,并將給臨床醫(yī)師一個更準確的參考標準和更好的治療手段。但是就目前對于膿毒癥的研究成果來說,還需要大樣本隨機對照試驗來驗證以使其更具普遍性和科學性。這樣才能廣泛應用于臨床為膿毒癥患者的診斷及預后提供更好的參考標準。