謝正+毛建文

【摘要】目的 探討血清來(lái)源的外泌體對(duì)小鼠燙傷傷口愈合的促進(jìn)作用及機(jī)制。方法 提取、分離并鑒定鼠血清中的外泌體。選取NIH小鼠建立皮膚深I(lǐng)I度燙傷模型。造模后用外泌體進(jìn)行治療，評(píng)估外泌體的療效，觀察皮膚組織的病理變化。檢測(cè)血清外泌體對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞增殖的影響以及血清外泌體對(duì)表皮Hacat細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果 成功建立小鼠深I(lǐng)I度皮膚燙傷模型。血清外泌體可以明顯縮小燙傷疤痕的面積。且能有效修復(fù)皮膚的附屬結(jié)構(gòu)和改善膠原纖維的排列。血清外泌體也能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和表皮Hacat細(xì)胞的遷移。結(jié)論 血清外泌體能促進(jìn)燙傷小鼠皮膚的愈合，有望為臨床燙傷的治療帶來(lái)新方法。

【關(guān)鍵詞】血清外泌體；深I(lǐng)I度燙傷；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

【中圖分類(lèi)號(hào)】R644 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2017.34..02

燙傷是日常生活中一種常見(jiàn)的意外傷害，通常是由于不下心接觸滾燙的液體或金屬所致。尤其是兒童的安全意識(shí)較低，更容易接觸一些高溫物體。燙傷過(guò)后如果不及時(shí)處理燙傷傷口，就很有可能引起皮膚壞死，留下后遺癥。燙傷后形成的硬痂不僅影響活動(dòng)和外觀，嚴(yán)重時(shí)甚至可以導(dǎo)致殘疾[1]。

燙傷后，皮膚內(nèi)部毛細(xì)血管破裂，出現(xiàn)紅腫，組織液滲出形成水泡[2]。外泌體因?yàn)榇嬖谟谘汉徒M織液中，所以可以直接接觸燙傷部位。外泌體是一種直徑為40-100nm的納米級(jí)雙分子層囊泡，外泌體由細(xì)胞分泌釋放出來(lái)，在血液等體液內(nèi)傳播，幾乎分布于全身各處[3]。外泌體通過(guò)攜帶mRNA，MicroRNA和蛋白質(zhì)等生物活性分子從而介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，從而發(fā)揮多種功能[4-5]。血清是血液的主要成分之一，血清中含有大量的外泌體，而血清中外泌體在燙傷修復(fù)中的作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討了血清外泌體在小鼠燙傷愈合中的作用及其機(jī)理，為燙傷的修復(fù)治療提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 血清外泌體的提取及鑒定

抽取小鼠血液，靜置1 h，離心2000 g，15 min后分離血清。離心2000 g，30 min去除細(xì)胞碎片，轉(zhuǎn)移至新離心管中，每管分裝1 mL血清。按賽默飛公司外泌體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟提取外泌體。電子透射顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)特征。Western blot檢測(cè)外泌體的特異性蛋白CD63和HSP70的表達(dá)。提取外泌體后，用BCA法測(cè)蛋白樣品的濃度后計(jì)算蛋白上樣量，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，TBS/T洗三次，用脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS/T洗三次后加入一抗（CD63，1：1000；HSP70，1：1000），冰箱4 ℃孵育過(guò)夜?；厥找豢购?，TBS/T洗三次，加入相對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。TBS/T洗三次，顯影、定影。

1.2 小鼠深I(lǐng)I度皮膚燙傷模型的建立及血清外泌體的治療

將體質(zhì)量為18～22 g的小鼠用10%水合氯醛麻醉后進(jìn)行背部脫毛和皮膚消毒處理，隨后將小鼠背部貼放在燙傷裝置上進(jìn)行造模。燙傷裝置由水浴鍋和隔熱木板組成，隔熱木板上設(shè)有孔徑為6 mm的圓洞。燙傷溫度和時(shí)間后最終確定水浴鍋溫度設(shè)置為85℃，燙傷時(shí)間為8秒。在每只小鼠背部?jī)蓚?cè)各燙出一個(gè)直徑為6 mm的圓形創(chuàng)面，隨后在小鼠其中一側(cè)燙傷部位周邊注射100 ?L PBS重懸的外泌體，另一側(cè)燙傷部位注射等量PBS，形成自身對(duì)照。每只小鼠造模后均單籠飼養(yǎng)。定期觀察小鼠燙傷創(chuàng)面愈合情況。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠成纖維細(xì)胞以1.5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100 ?L細(xì)胞懸液。設(shè)4組，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3次。每孔加入100 ?L DMEM培養(yǎng)基。隨后加入3種不同濃度的外泌體懸液，空白組加等量PBS。培養(yǎng)24h后，每孔加入MTT 20 ?L，培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150 ?L DMSO，振蕩10 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的表皮細(xì)胞Hacat以25×104個(gè)/mL的密度接種于12孔板，每孔1 mL細(xì)胞懸液。設(shè)2組，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，用200 ?L槍頭在每孔底部中間劃一道細(xì)線(xiàn)，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3次。每孔加入1mL DMEM培養(yǎng)基，隨后兩組分別加入外泌體懸液和等量PBS。培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下拍攝細(xì)胞遷移情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%），例（n）表示，采用x2檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體的形態(tài)與鑒定

血清外泌體在電鏡下的形態(tài)為雙分子層圓形結(jié)構(gòu)。Western bolt結(jié)果顯示，外泌體試劑盒提取的血清外泌體可以檢測(cè)出特異性標(biāo)記蛋白CD63和HSP70。

2.2 血清外泌體促進(jìn)小鼠燙傷皮膚創(chuàng)面的愈合

動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)顯示，相對(duì)于空白對(duì)照，血清外泌體能顯著促進(jìn)小鼠深二度燙傷創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間。

2.3 血清外泌體對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示：不同劑量的血清外泌體作用24 h后，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。PBS、2 ul Exo、5 ul Exo、10 ul Exo組24 h的OD值分別為（0.630±0.118）、（0.774±0.098）、（1.060±0.087）、（1.174±0.089）。

10 ul/孔濃度的外泌體也呈時(shí)間依賴(lài)性地促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。10 ul Exo組的OD值在0、1、2、3天分別為（0.563±0.084）、（1.110±0.159）、（1.364±0.208）、（1.408±0.159），PBS組的OD值在0、1、2、3 天分別為（0.571±0.076）、（0.731±0.113）、（1.044±0.152）、（1.121±0.136）。endprint

2.4 血清外泌體對(duì)表皮Hacat細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：血清外泌體可以顯著地促進(jìn)Hacat細(xì)胞的遷移，外泌體組和PBS組在24 h的遷移率分別為（64.55±4.85）、（33.25±5.35）。外泌體組與PBS處理組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.01）。

3 討 論

雖然外泌體早在在1983年就被發(fā)現(xiàn)[6]，但一直未受到人們的重視。然而通過(guò)近幾年的研究，人們發(fā)現(xiàn)了外泌體在免疫中抗原呈遞[7]、腫瘤的生長(zhǎng)與遷移[8]、組織損傷的修復(fù)[9]等多個(gè)領(lǐng)域的作用。

在燙傷的修復(fù)過(guò)程中，燙傷的皮膚組織和細(xì)胞通常不能靠原來(lái)性質(zhì)的細(xì)胞修復(fù)，而是由成纖維細(xì)胞增生來(lái)填補(bǔ)受損的組織，成纖維細(xì)胞的增殖對(duì)愈合速率有較大的影響。成纖維細(xì)胞通過(guò)大量增殖，合成和分泌的膠原纖維和基質(zhì)成分，與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織，填補(bǔ)缺損壞死組織，為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件[10-11]。在燙傷修復(fù)的最終階段，隨著硬痂的脫落，表皮細(xì)胞的遷移完成覆蓋。

我們的結(jié)果證實(shí)了血清外泌體能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，并能顯示出量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系，并且本實(shí)驗(yàn)也顯示血清外泌體能促進(jìn)Hacat細(xì)胞的遷移。然而，血清外泌體促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖和表皮細(xì)胞遷移的機(jī)制目前尚未明確，值得進(jìn)一步的深入探討。本研究采用的是皮下注射給藥，相對(duì)于涂抹的給藥方式，不受皮膚通透性的影響。血清外泌體源于血液，相對(duì)于傳統(tǒng)燙傷中成藥而言，刺激性小，生物親和性高，不會(huì)加重傷口的不適。我們的研究也顯示血清外泌體對(duì)燙傷小鼠有較好的療效的同時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)紅腫等排斥現(xiàn)象。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體能促進(jìn)小鼠燙傷創(chuàng)面的愈合，為臨床皮膚燙傷的治療提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Ebrahim MK，Bang RL，Lari AR，et al. Scald accidents during water aerosol inhalation in infants[J].Burns.1990，16（4）：291-3.

[2] Walker AR.Fatal tapwater scald burns in the USA，1979-86[J].Burns.1990，16（1）：49-52.

[3] Skamagki M，Zhang C，Ross CA，et al.RNA Exosome Complex-Mediated Control of Redox Status in Pluripotent Stem Cells[J].Stem Cell Reports. 2017， 9（4）：1053-1061.

[4] Kim J，Tan Z，Lubman DM.Exosome enrichment of human serum using multiple cycles of centrifugation[J].Electrophoresis.2015，36（17）：2017-26.

[5] Agarwal K，Saji M，Lazaroff SM，et al.Analysis of exosome release as a cellular response to MAPK pathway inhibition.Langmuir.2015，31（19）：5440-8.

[6] Johnstone RM，Adam M，Hammond JR，et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities with released vesicles （exosomes）[J].Biol.Chem.1987，262 （19）：9412–20.

[7] Tkach M，Kowal J，Zucchetti AE，et al.Qualitative differences in T-cell activation by dendritic cell-derived extracellular vesicle subtypes[J].EMBO.2017，36（20）：3012-3028.

[8] Hosseini-Beheshti E，Choi W，Weiswald LB，et al.Tomlinson Guns ES. Exosomes confer pro-survival signals to alter the phenotype of prostate cells in their surrounding environment[J].Oncotarget.2016，7（12）：14639–14658.

[9] Zhang B，Shi Y，Gong A，et al.HucMSC Exosome-Delivered 14-3-3ζOrchestrates Self-Control of the Wnt Response via Modulation of YAP[J].Stem Cells. 2016， 34（10）：2485-2500.

[10] Mohsina A，Kumar N，Sharma AK，et al.Polypropylene mesh seeded with fibroblasts：A new approach for the repair of abdominal wall defects in rats[J].Tissue Cell.2017，49（3）：383-392.

[11] 王英慧.成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性及其成骨作用的研究進(jìn)展[J].大同醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào).2006， 2：30-31.

本文編輯：李 豆endprint