沈娟娟+鄧悅+路方平+馬金玲+田野+王聞靖+張冰銳

【摘要】目的 研究觀察豁痰解毒通絡方對頸動脈球囊損傷術后再狹窄大鼠，主動脈平滑肌細胞增生信號通路的調(diào)控機制和相關指標。方法 采用SD大鼠建立大鼠頸動脈球囊損傷動物模型；隨機分為假手術組、模型組、豁痰解毒通絡組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡組+辛伐他汀組。采用免疫組化法檢測大鼠頸動脈組織ERK、NF-κB蛋白的表達。結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果提示：假手術組無陽性著色。模型組可見較多棕黃色細胞核?；硖到舛就ńj組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡+辛伐他汀組陽性著色與模型組比較顯著改善。結(jié)論 豁痰解毒通絡飲可以有效抑制大鼠頸動脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的增殖，可能通過抑制ERK1/2、NF-κB信號通路來抑制新生內(nèi)膜的增殖。

【關鍵詞】豁痰解毒通絡；PTCA術后再狹窄；血管重構；細胞增殖

【中圖分類號】R28 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2017.32..02

心血管疾病目前已成為威脅人類健康與生命的頭號殺手，其發(fā)病率和死亡率超過腫瘤性疾病躍居第一[1]。經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）后再狹窄（restenosis，RS）是影響冠狀動脈粥樣硬化性心臟病介入治療預后的關鍵問題，嚴重制約了經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）的遠期療效，成為心血管領域的研究熱點和難點[2]。隨著對 RS 分子水平機理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)許多因素如細胞因子、生長因子等可通過活化細胞外信號調(diào)節(jié)氨基末端蛋白激酶（JNK）、p38 絲裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號通路影響細胞周期蛋白及凋亡相關基因，在 VSMC 增殖、分化、凋亡以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-4]。針對PTCA后再狹窄，VSMC 增殖與凋亡調(diào)控因素的干預是 RS 防治的切入點。近年來，中醫(yī)藥防治PTCA后再狹窄的研究漸趨活躍。中藥具有穩(wěn)定性好，毒副作用小等特點，己經(jīng)越來越受到人們關注。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠60只，50日齡，重量（350±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 藥品與試劑

中藥：豁痰解毒通絡飲：雙花，當歸，甘松，丹參等藥物組成。生藥由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供，含生藥量為2.33 g/mL。辛伐他汀片（遠大醫(yī)藥中國有限公司，批號：H20000107，規(guī)格：5 mg）。

1.1.3 實驗儀器

迷你轉(zhuǎn)印電泳儀（北京鼎國昌盛生物有限公司，DYCZ-24D）；低速水平離心機 （湖南相依離心機儀器有限公司，L-550）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備

大鼠適應性喂養(yǎng)7天。術前背部皮下注射低分子肝素鈉注射液，預防急性血栓形成，劑量為500 U/kg。注射1 h后進行造模。腹腔麻醉大鼠。固定大鼠取正中切口，分離并且暫時阻斷左頸總動脈、左側(cè)頸外動脈、左側(cè)頸內(nèi)動脈。結(jié)扎小分支。在左頸總動脈近心端采用動脈夾暫時阻斷后，于頸內(nèi)動脈遠心端用眼科剪一小切口，在導絲引導下插入3.0×15 mmRunjin球囊導管，迅速插入球囊導管，緩慢伸至頸總動脈近心端處，導管插入深度約4 cm，采用醫(yī)用球囊擴張壓力泵（l～2 atm）充盈球囊，以生理鹽水充盈球囊（壓力0.6～0.8 atm），持續(xù)30 s后，使球囊膨脹至回拉時有較明顯的阻力感，保持阻力一致緩慢向遠心端旋轉(zhuǎn)回拉，球囊至頸總動脈分叉處，將球囊泄壓至0 atm，再次重復以上步驟，反復操作3次。撤出球囊后，迅速結(jié)扎左側(cè)頸外動脈，開通頸內(nèi)動脈和頸總動脈血運循環(huán)，分層縫合頸部傷口。術后腹腔注射青霉素抗炎，背部皮下注射低分子肝素鈉注射液抗凝3天。假手術組大鼠只分離并結(jié)扎左側(cè)頸外動脈，不做球囊拉傷處理。

1.2.2 分組給藥

于術后第2天起連續(xù)灌胃30天。假手術組、模型組灌胃等量蒸溜水，豁痰解毒通絡組灌胃豁痰解毒通絡方1.633 g/mL。辛伐他汀組灌胃辛伐他汀0.119 mg/mL?；硖到舛就ńj方+辛伐他汀組灌胃豁痰解毒通絡方1.633 g/mL及辛伐他汀0.119 mg/mL。每日1次，給藥30天。

1.2.3 免疫組化染色法檢測大鼠頸動脈ERK、NF-kB的表達

常規(guī)脫蠟至水洗，檸檬酸鹽熱修復，然后室溫冷卻；清洗；滴加阻斷劑，清洗；加封閉液；滴加一抗（ERK抗體效價1：100、NF-κB抗體效價1：100），4℃靜置過夜；清洗；滴加生物素標記的抗鼠/兔IgG的第二抗體，清洗；滴加辣根過氧化酶標記的鏈霉菌抗生物素蛋白，清洗；滴加顯色劑，光鏡下觀察，顯色適當用水終止；Mayer蘇木素復，蒸餾水沖洗；弱氨水返藍，蒸餾水沖洗；脫水、透明、中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計學軟件

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以百分數(shù)（%），例（n）表示，采用x2檢驗；計量資料以“x±s”表示，采用t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色法檢測大鼠頸動脈NF-κB的表達

NF-κB通常狀況下存在于胞漿，活化后進入核內(nèi)，免疫組化染色陽性細胞表現(xiàn)為胞核呈棕黃色，并可見棕黃色顆粒沉積。假手術組無陽性著色。球囊損傷術后30天模型組和假手術組可見血管壁新生內(nèi)膜細胞較多棕黃色細胞核。豁痰解毒通絡組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡+辛伐他汀組陽性著色與模型組比較顯著改善。

2.2 免疫組化染色法檢測大鼠頸動脈ERK的表達endprint

p-ERK通常狀況下存在于胞質(zhì)，活化后進入核內(nèi)，免疫組化染色陽性細胞表現(xiàn)為胞核呈棕黃色，并可見棕黃色顆粒沉積。假手術組無陽性著色。球囊損傷術后 30 天模型組和假手術組可見明顯棕黃色細胞核?；硖到舛就ńj組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡+辛伐他汀組陽性著色與模型組比較顯著改善。

3 討 論

由于球囊反復、持續(xù)對血管壁進行刺激，受累血管壁細胞不斷激活炎性等刺激因子逐漸形成慢性炎癥。由于刺激因子持續(xù)存在，在其長期刺激引導下炎性因子表達增高[5]。在其外力持續(xù)刺激下血管平滑肌細胞增殖、遷移，致內(nèi)膜不斷增生，進一步血管重塑形成血管再狹窄。

在慢性炎癥過程中，損傷的血管平滑肌細胞可釋放大量活性物質(zhì)，這與中醫(yī)所述病理性津液滯留所致“痰”的理論一致[6]。而慢性炎癥過程中血小板黏附、聚集及血栓的產(chǎn)生、纖維斑塊及結(jié)締組織的形成、單核細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎趦?nèi)皮下的沉積、血液粘稠度增高等現(xiàn)象，又符合中醫(yī)“瘀”的具體表現(xiàn)[7]。中醫(yī)認為，“痰”與“瘀”常共同致病，痰瘀互結(jié)，蘊結(jié)成毒，“毒”損脈絡，加重血管的損傷。

我們根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學對RS發(fā)生發(fā)展的新認識，以“伏邪多與痰瘀相關”為突破口，提出“痰瘀互結(jié)，毒損心絡可能是PTCA術后再狹窄主要機制”假說。治療應以“豁痰解毒，化瘀通絡”為治療原則。探討豁痰解毒通絡飲干預RS后內(nèi)膜增生的作用機制，從而達到防治血管再狹窄目的。因此，我們確立以“痰瘀互結(jié)，毒損心絡”為切入點，以豁痰解毒，化瘀通絡為治療原則，探討中藥復方通過干預炎癥反應防治RS的作用機制。對明確了解中醫(yī)藥干預RS其作用機制奠定了理論基礎。

參考文獻

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本文編輯：李 豆endprint