李曉琴，朱紅革，劉春玲

（新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 肺內二科，新疆 烏魯木齊 830011）

康萊特對于中晚期肺癌、肝癌及結直腸癌等具有一定的療效，同時還能調節(jié)機體的免疫系統，增強放、化療殺傷腫瘤細胞的效果。大量研究表明，其具有抑制腫瘤細胞增殖和調節(jié)免疫等綜合效果[1]。隨著現代醫(yī)藥研發(fā)和中醫(yī)藥逐步結合，將有大量的抗癌中藥用于腫瘤患者[2]。抗腫瘤藥物的研發(fā)和臨床實驗需要確定腫瘤藥物治療的最佳作用時間和藥物濃度、藥物療效和機體副作用間的平衡，以及殺傷腫瘤細胞的機制，因此需要進行實時有效的監(jiān)測腫瘤變化，這些都是病理學檢測所不具備的[3]。分子影像學技術是將一種或者幾種具有成像功能的分子標志物打入到體內，這些標志物能夠與體內腫瘤細胞特異性結合，在影像學下顯示腫瘤病變的各種信息[4]。現在很多抗腫瘤藥物就是基于腫瘤的血管依賴性進行設計的[5]。目前，診斷血管新生的金標準是微血管密度（microvascular density，MVD），然而其測量方法創(chuàng)傷大，不能實時監(jiān)測和反復測量，不能應用于抗腫瘤藥物療效的檢測[6-7]。臨床上，MRI廣泛用于評價腫瘤的生成狀況，可作為一種有效的手段，持續(xù)評價抗腫瘤藥物的療效[8]。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

免疫組織化學染色試劑盒、DAB濃縮試劑盒、PBS濃縮粉末、枸櫞酸修復液購自北京中杉金橋生物科技有限公司，CD34、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體購自美國Abcom生物技術公司，Aneexin-V FITC/PI凋亡流式細胞術檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），VEGF酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、癌胚抗原ELISA檢測試劑盒購自廣州慧嘉生物科技公司。

1.2 實驗動物、細胞及分組

康萊特注射液（浙江康萊特藥業(yè)有限公司）。實驗動物采用BALB/c-nu裸鼠，共20例，均為雄性，鼠齡6～8周，體重約18 g。

人結腸癌細胞株HT-29（上海生命科學研究院的細胞庫）。取4～6代處于對數生長期的細胞，生長狀態(tài)差或者代數高的細胞均不用于實驗。

裸鼠的右后肢皮下接種人結腸癌HT-29細胞成瘤，其中10例為對照組，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1 ml/（d·只）；10例為治療組，腹腔注射1 ml康萊特注射液1 ml/（d·只），兩組治療時間均為7 d。

1.3 方法

1.3.1 細胞復蘇、培養(yǎng)與傳代復蘇后的細胞傳代≥1代后用于實驗，以減少凍存液對細胞的損傷和對實驗結果的影響。本實驗選取第4～6代對數生長期的細胞進行實驗研究。

1.3.2 細胞增殖與凋亡細胞增殖與凋亡采用5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EDU）細胞增殖檢測及Annexin-V FITC/PI凋亡的流式細胞術檢測

1.3.3 HT-29細胞成瘤接種液的制備及皮下接種取對數生長期的人結腸癌HT-29細胞，PBS清洗3次后，用無菌PBS制成接種腫瘤細胞懸液，在潔凈操作室中接種1 ml至裸鼠的右后肢皮下組織，接種時注意無菌操作。由2位測量者用游標卡尺測量腫瘤底部的最大（a）和最小直徑（b），按照公式體積（V）=ab2π/6，計算各組裸鼠皮下成瘤的體積大小，對照組皮下成瘤體積＞200 mm3表明本實驗成瘤操作成功。

1.4 MRI的檢測方法

1.4.1 MRI的檢測時間和設備待裸鼠右下肢的皮下成瘤大小達到模型復制成功的標準，10～15 d時進行MRI掃描檢測。采用1.5T Tim Avanto 磁共振掃描儀（德國西門子公司）檢測腫瘤的大小和血管情況，采用上海辰光醫(yī)療科技公司研發(fā)的25 mm實驗動物專用射頻線圈進行裸鼠的MRI掃描（專利號：ZL201020236347.3）。

1.4.2 裸鼠的麻醉采用10%水合氯醛進行麻醉，麻醉前在天平上精確測量裸鼠的體重，按照0.4 ml/100 g的劑量進行腹腔麻醉。

1.4.3 MRI成像參數設定MRI的具體參數根據掃描序列進行相應調整。根據預實驗所得的MRI掃描序列、參數及圖像，T1WI-TSE序列：TR=280，TE=18，層厚2 mm，層間距0.0 mm，層數10層，FOV=70，信號平均次數（number of signal averaged，NSA）3次，矩陣256×256；T2WI-TSE序列：TR=3 000，TE=82，層厚2 mm，層間距0.0 mm，層數10層，FOV=70，NSA 3次，矩陣512×512；磁共振彌散加權成像（diffusion weighted imaging，DWI）序列：10個擴散敏感梯度因子b值，分別為0、50、100、150、200、250、300、500、750 和 1 000 s/mm2，TR=24 00，TE=101，層厚2 mm，層間距0.0 mm，層數10層，FOV=60，NSA 6次，矩陣80×80。

1.4.4 圖像的處理和分析采用Biomap軟件處理DWI圖像，首先計算出ADC值并繪出ADC圖像，先根據10個b值擬合出ADC10b圖，再分別取3個低b值（0、50和100 s/mm2）擬合出ADClow圖，提取3個高b值（500、750和1 000 s/mm2）擬合出ADChigh圖，將ADClow與ADChigh的差值定義為ADCperf值。根據0、500和1 000 s/mm2擬合出ADC3b圖，每個ADC值的計算提取≥3個不同的b值，以便提高結果的準確性，最后分析出腫瘤組織的感興趣區(qū)及其像素分布。

1.5 瘤體的大小與取材

接受結腸癌HT-29細胞注射的裸鼠采用單個籠喂養(yǎng)，并堅持每隔一段時間更換墊料和食物，保證裸鼠喂養(yǎng)環(huán)境的潔凈和干燥，并預防各種病原體的感染。一段時間后，根據實驗需要，用10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉裸鼠后，用相機拍照，記錄成瘤體的大小。用IPP 6.0軟件計算各組瘤體的大小及組間差異。每次拍照后，用剪刀分離皮下的成瘤體，取下整個成瘤體，PBS清洗后，用4%多聚甲醛固定。根據MRI掃描圖像，實驗選取與橫斷位對應的腫瘤最大橫徑切面進行石蠟切片。每個樣本切6張組織切片，切片厚度4μm。

1.6 免疫組織化學法

包埋成瘤體組織，石蠟切片，切片脫蠟。封閉抗原，孵育一抗、二抗?？乖?、抗體結合顯色，切片復染、脫水、封片。

1.7 MVD的測定

使用CD34抗體染色，判定標準采用Weidner改進式方法。先在低倍鏡（×100）下掃視整個玻片，找出MVD最大的熱點后，變換高倍鏡（×200）觀察并計數。任何被抗體染成棕色的單個細胞或細胞團，不管有無形成管腔，只要與周圍的微血管、腫瘤組織及其他結締組織界限清楚，都作為1條可計數的血管。腫瘤內硬化區(qū)，以及與腫瘤交界處軟組織內的微血管不作計數；具有厚的平滑肌或管腔面積＞8個紅細胞直徑的血管也排除在外。記錄5個視野的微血管數，取其平均數作為MVD。

1.8 VEGF的測定

使用VEGF單克隆抗體染色，采用兼顧VEGF陽性染色強度和陽性細胞百分比作為判斷標準。在排除非特異染色前提下，按染色強度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽性細胞百分比計分：陰性為0分，陽性細胞百分比＜10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3分為免疫反應陽性。并按乘積分數分為4個等級：0～2分為陰性（-）、3～5分為弱陽性（+）、6～8分為陽性（++）、9～12分為強陽性（+++）。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗或方差分析；計數資料以率表示用χ2檢驗；相關分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 康萊特注射液對人結腸癌HT-29細胞增殖的影響

加入康萊特注射液作用7 d后，兩組人結腸癌HT-29細胞增殖率比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），治療組較對照組降低33.113%。見表1和圖1。

2.2 康萊特注射液對人結腸癌HT-29細胞凋亡的影響

兩組人結腸癌HT-29細胞凋亡率比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），治療組較對照組升高28.243%。見表2和圖2。

2.3 康萊特抑制裸鼠皮下移植瘤的生長

在裸鼠皮下接種人結腸癌HT-29細胞后5 d，裸鼠在右后肢出現米粒大小的小成瘤體，未見潰瘍，皮膚光滑完整，證明模型復制成功。接種15 d后，接種部位出現明顯隆起，其體積均達到300 mm3，瘤體質地硬，活動度差，與皮膚緊密結合，證明模型復制成功，成功率為100%?？等R特注射后7 d，皮下移植瘤體積下降，相對于對照組，體積下降49%。

2.4 康萊特注射液對裸鼠結腸癌皮下移植瘤DWI的影響

MRI的b值增加使兩組皮下移植瘤DWI的清晰程度逐漸降低，并出現圖像變形，同時腫瘤信號增加強度也不清晰，與周圍組織的邊界也逐漸模糊?？等R特注射液治療后引起腫瘤壞死區(qū)域變得模糊。在兩組ADC顯示圖表明，腫瘤呈低信號，邊界清晰；而康萊特注射液治療后7 d存在高信號斑點或片狀局部液性暗區(qū)。治療組DWI指標與對照組比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1 兩組人結腸癌HT-29細胞增殖率比較（n =10，%，±s）

表1 兩組人結腸癌HT-29細胞增殖率比較（n =10，%，±s）

圖1 兩組人結腸癌HT-29細胞增殖率比較（n =10，±s）

2.5 康萊特注射液抑制裸鼠結腸癌皮下移植瘤血管的生成

治療后7 d，治療組、對照組的VEGF陽性表達的率分別為43%和58%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=3.306，P=0.021）。治療組CD34染色陽性的新生血管降低，僅在腫瘤的邊緣部分可見。兩組MVD計數、VEGF計分、PCNA陽性細胞百分比比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），治療組PCNA陽性細胞百分比較對照組下降55%。見表4和圖 3、4。

2.6 MVD參數與DWI的相關性

治療后7 d，兩組ADCperf值與MVD呈正相關，ADC10b與 MVD 呈負相關（P＜0.05）。見表 5、6。

表2 兩組人結腸癌HT-29細胞凋亡率比較（n =10，%，±s）

表2 兩組人結腸癌HT-29細胞凋亡率比較（n =10，%，±s）

圖2 兩組人結腸癌HT-29細胞凋亡率比較（n =10，%，±s）

表3 兩組治療后DWI指標比較 （n =10，×10-3 mm2/s，±s）

表3 兩組治療后DWI指標比較 （n =10，×10-3 mm2/s，±s）

對照組 0.234±0.026 0.044±0.005 0.141±0.013 0.030±0.004 0.101±0.006治療組 0.316±0.037 0.059±0.005 0.109±0.006 0.043±0.005 0.090±0.006 t值 4.968 6.869 5.327 9.345 5.821

表4 兩組治療后MVD計數、VEGF計分、PCNA陽性細胞百分比比較 （n =10，±s）

表4 兩組治療后MVD計數、VEGF計分、PCNA陽性細胞百分比比較 （n =10，±s）

對照組 11.701±2.524 4.432±1.074 91.234±8.227治療組 4.958±1.963 2.218±1.034 49.617±4.363 t值 4.957 6.122 10.284

圖3 抗腫瘤血管藥物治療前移植瘤組織CD34染色（免疫組織化學法×200）

圖4 抗腫瘤血管藥物治療后移植瘤組織CD34染色（免疫組織化學法×200）

表5 治療組DWI參數與MVD的相關性分析

表6 對照組DWI參數與MVD的相關性分析

3 討論

研究表明，DWI圖像可以反映早期腫瘤內部變化及療效，在評估化學藥物治療腫瘤中具有很好的效果[9-10]。在未治療的結腸癌皮下移植瘤，ADCperf值與血流灌注緊密相關，隨著灌注量的增加，其不斷變大，因此可以反映血流的情況。本研究結果發(fā)現，康萊特注射液治療后，ADCperf值下降，這說明中藥康萊特注射液可以有效降低結腸癌皮下瘤的血流灌注。同時本研究也結果證實，ADCperf值與MVD計數呈正相關。ADChigh值主要與水分子的運動功能相關密切，因此ADChigh值越高，腫瘤內部血流速度也越快，對營養(yǎng)和氧氣的供給也越豐富。本研究結果發(fā)現，康萊特注射液治療后，ADChigh值下降，說明中藥康萊特注射液可以降低腫瘤內部營養(yǎng)和氧氣的供給，達到進一步抑制腫瘤的目的。本實驗結果證明，ADChigh值與MVD計數呈正相關。本研究還發(fā)現，康萊特注射液治療后，VEGF計分與ADClow值呈正相關，其可能的原因是體外實驗發(fā)現康萊特注射液可以誘導結腸癌細胞的凋亡，水腫是凋亡的一種狀態(tài)，最終引起細胞內水分子運動減少，即ADClow值的改變。PCNA計分與ADChigh呈負相關。因此，DWI參數特別是ADCperf值、ADC3b及ADC10b，可以作為評估中藥抗腫瘤療效的有效指標，具有很強的臨床研究價值。

康萊特注射液能抑制人結腸癌HT-29細胞增殖，用于體內實驗將具有很好的療效?？等R特能促進人結腸癌HT-29細胞的凋亡，在動物實驗中均能達到很好的抑制皮下成瘤體生長，以及抑制腫瘤血管生成的作用。

康萊特能抑制裸鼠的人結腸癌皮下移植瘤生長，其機制可能是通過促進其凋亡和抑制增殖來實現的[11-12]。免疫組織化學結果顯示，康萊特注射液治療能抑制新生血管生成和腫瘤細胞的增殖活力。DWI參數可以作為評估抗腫瘤中藥療效的有效手段，其中ADCperf值、ADC3b及ADC10b與康萊特注射液治療后的免疫組織化學結果有相關性，因此可以作為評估中藥抗腫瘤療效的有效指標，具有很強的臨床應用和研究價值。

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