陳小松+閆柳+陳瑛等

[摘要]目的：本研究通過建立肥胖小鼠動物模型，分析比較膽汁酸膜受體TGR5多種配體的減肥及降糖效果，以篩選出TGR5最佳配體。方法：選取6周齡C57BL/6野生型小鼠，隨機分為2組，分別用NF、HF喂養(yǎng)10周后，NF組小鼠采用NF繼續(xù)喂養(yǎng)10周；將HF組小鼠分為7組，分別用HF、HF+OA（H）、HF+OA（L）、HF+CDCA、HF+CA、HF+DCA、HA+LCA喂養(yǎng)10周。共喂養(yǎng)20周后進行糖耐量實驗、測定血清胰島素水平并取肝臟脂肪組織做病理學觀察，RT-PCR法檢測脂肪酸合成與脂肪代謝相關(guān)基因表達情況。喂養(yǎng)過程中每周監(jiān)測小鼠體重。結(jié)果：TGR5多種配體可激活TGR5調(diào)節(jié)肥胖小鼠體內(nèi)糖脂代謝，降低小鼠體重、提高小鼠糖耐量水平，激活脂肪酸合成及氧化相關(guān)基因的表達，其中以O(shè)A（H）、CDCA和cA作用較為顯著。結(jié)論：OA（H）、CDCA和CA可有效降低體重、提高糖耐量水平、降低血清胰島素水平、緩解肝臟脂質(zhì)沉積及調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因的表達。

[關(guān)鍵詞]TGR5配體；褐色脂肪；肥胖；糖脂代謝

[中圖分類號]R589.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）07-0032-05

肥胖已成為當代重大公共衛(wèi)生問題之一，并可增加高血壓、冠心病和糖尿病等的發(fā)病風險。肥胖，即為白色脂肪組織（white adipose，WAT）的積累，于能量攝入大于能量消耗時發(fā)生。減肥和增加體力活動被認為是治療肥胖最有效的方法，但是在許多情況下，這些生活方式的改變并不能長期堅持。另外，許多減肥藥也因其不良副作用而退出市場，因此，開發(fā)新的安全有效的減肥藥物成為治療肥胖不可或缺的手段。

TGR5是首個被鑒定的膽汁酸膜G蛋白偶聯(lián)受體，在糖類及能量代謝中均發(fā)揮著重要作用。TGR5高表達于褐色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）線粒體，在調(diào)節(jié)糖代謝中起著重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，激活TGR5能夠消耗能量達到減肥的效果，那么天然或半合成的TGR5的配體就很有可能開發(fā)為減肥藥物。齊墩果酸（oleanolic acid，OA）是TGR5的天然植物配體，可使高脂飲食的動物體重下降，而且已被證實這種作用是通過激活TGR5實現(xiàn)的。除了OA外，初級膽汁酸膽酸（cholic acid，CA）和鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA），次級膽汁酸脫氧膽酸（deoxycholie acid，DCA）和石膽酸（lithocholic acid，LCA），亦是TGR5天然配體，均可作為信號分子參與能量代謝。膽汁酸-TGR5-cAMP-D2-T3-UCP信號通路在調(diào)節(jié)能量平衡和降低體重方面有著重要的作用。在本次研究中，筆者采用高脂飲食誘導形成后天肥胖小鼠模型，評估膽汁酸不同配體降低高脂肪飲食引起的肥胖和改善葡萄糖耐量的能力，以篩選出TGR5最佳配體，為抗肥胖藥的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實驗動物：選取6周齡C57BL/6野生型小鼠，體重15～20g，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學實驗動物中心，隨機分為實驗組和對照組。所有動物均按照實驗動物護理和使用指南予以對待，所有實驗均獲得福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會的批準并依據(jù)委員會指導方針進行。

1.2試劑：OA、CDCA、DCA、LCA、CA，均購自Sigma（St.Louis，MO，USA）；蘇木精伊紅和血清胰島素檢測試劑盒購自羅氏應(yīng)用科學（Indianapolis，IN，USA）；其他試劑均購自Sigma。

1.3營養(yǎng)性肥胖動物模型的建立：所有小鼠置于25℃環(huán)境中，12h光照/12h黑暗交替。實驗組小鼠飼喂高脂飼料（碳水化合物40%，蛋白質(zhì)13%，脂肪40%，其他7%），即高脂（high fat diet，HF）組；對照組飼喂普通飼料（碳水化合物60%，蛋白質(zhì)22%，脂肪10%，其他8%），為正常飲食（normal food diet，NF）組。動物自由攝食和飲水。

1.4藥物干預(yù)：小鼠肥胖模型成功建立后，盯組小鼠隨機分為七組（n≥5），一組采用單純盯持續(xù)飼養(yǎng)，其余各組高脂飼料中加入不同干預(yù)藥物：OA（H）：100mg/kg，OA（L）：80mg/kg，CDCA：5g/kg，DCA：2g/kg，LCA：1g/kg，CA：5g/kg，持續(xù)10周，每周監(jiān)測小鼠體重。

1.5葡萄糖耐量實驗與血清胰島素水平檢測：喂養(yǎng)結(jié)束后，小鼠饑餓16h，然后給予腹腔內(nèi)注射葡萄糖（2g/kg），并以微型血糖儀（中國寧波kingkerry醫(yī)療器械有限公司）監(jiān)測從0～120min時的血糖變化；血清胰島素水平使用ELISA試劑盒測量，全血在4℃離心機中以2000g離心10min獲得血清。

1.6免疫組織化學染色：喂養(yǎng)周期結(jié)束后，所有小鼠以CO₂氣體實施安樂死。從每只小鼠右葉肝臟取一定量肝臟組織，固定在PBS溶解的4%福爾馬林溶液中，以制備石蠟切片或冰凍切片，用蘇木精伊紅染色；分離各組小鼠WAT及BAT進行油紅O染色。

1.7 RT PCR檢測脂肪酸合成與脂肪代謝相關(guān)基因表達情況：從組織樣本中以TRI試劑（Molecular Research Center，Cincinnati，OH，USA）提取總RNA，用goloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，San Diego，CA，USA）從總RNA合成第一鏈cDNA。以小鼠管家基因β-actin為內(nèi)參基因?qū)RNA進行標準化定量，使用Applied Biosystems 7300實時PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）采用實時熒光定量PCR法對WAT和BAT中氧化相關(guān)因子如解偶聯(lián)蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）、2型碘甲腺氨酸脫碘酶（2-iodothyronine deiodinase，D2）及環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）基因表達水平進行檢測。特定上游（F）和下游引物（R）序列如表1所示。endprint

1.8統(tǒng)計學分析：相關(guān)數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，雙邊t檢驗進行組間比較。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1體重測量結(jié)果：所有小鼠共喂養(yǎng)20周，每周監(jiān)測小鼠體重，具體測量數(shù)據(jù)如圖1A；喂養(yǎng)周期結(jié)束后，將小鼠體重進行組間比較，結(jié)果表明，與其他組喂飼高脂飼料的小鼠相比，飼料中加入OA（H）、CDCA或CA后，這些小鼠雖飼喂高脂飲食，但體重和NF組小鼠無明顯差異，與HF組相比，小鼠體重明顯降低（P<0.05），見圖1B。

2.2葡萄糖耐量實驗及血清胰島素水平檢測結(jié)果：喂養(yǎng)周期結(jié)束后，小鼠空腹16h，給予腹腔注射葡萄糖（2g/kg），采用微型血糖儀測量0～120min的血糖水平，結(jié)果表明，與HF組小鼠相比，在高脂飼料中加入OA（H）、CDCA或cA以后，小鼠血糖水平明顯下降（P<0.05），與正常飲食組小鼠血糖水平相當，結(jié)果見圖1C～D；小鼠實施安樂死后，用ELISA法測定血清胰島素水平（圖1E），結(jié)果顯示，CDCA組、CA組小鼠的血清胰島素水平明顯低于盯組小鼠（P<0.05）。

2.3 HE染色結(jié)果：如圖2A所示，與正常飲食相比，高脂飲食能夠促進脂質(zhì)顆粒的聚積，如高分辨率圖像上黑色箭頭所示，這種現(xiàn)象在飼料中加入OA（H）、CA，尤其是CDCA后被逆轉(zhuǎn)；OA（H）、CDCA、CA組的肝臟重量與正常飲食組小鼠無異，明顯小于HF組小鼠（P<0.05），見圖2B。

2.4油紅O染色結(jié)果：各組肝臟脂肪組織病理切片情況詳見圖3A，脂肪含量檢測結(jié)果見圖3B，結(jié)果表明，OA（H）、CDCA組中的WAT與單純HF組小鼠相比，脂肪聚積并無明顯差異；OA（H）、CDCA、CA組中的BAT明顯少于HF組小鼠體內(nèi)的脂肪聚積。

2.5脂肪酸合成與脂肪代謝相關(guān)基因表達測定結(jié)果：對WAT而言，各組中的cAMP、UCP2及D2值無明顯差異；而BAT中測量結(jié)果顯示，OA（H）、CDCA及CA組中cAMP、UCP2及D2值均明顯高于HF組（P<0.05），見圖4。

3討論

哺乳動物的脂肪組織主要包括WAT及相對少量的BAT。WAT是能量儲存的主要部位，可分泌多種細胞因子和激素，調(diào)節(jié)能量代謝和胰島素抵抗。BAT對成人能量代謝的影響于2009年才被發(fā)現(xiàn)，其包含許多小脂滴和較多數(shù)量的線粒體數(shù)目。BAT表達解偶聯(lián)蛋白（uncoupling protein，UCP），UCP能夠解偶聯(lián)ATP合成呼吸鏈的活性，通過產(chǎn)熱作用消耗能量。1983年，在Rothwell和Stock的一項人體試驗研究中發(fā)現(xiàn)，僅50g BAT在完全激活后每天可增加人體20%的能量消耗。利用BAT對抗肥胖已成為一種潛在的治療措施，而且越來越多的證據(jù)表明，BAT募集或BAT移植可以有效地降低體重，提高能量代謝。

TGR5是調(diào)節(jié)膽汁酸信號通路的新型膜受體，在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，TGR5可以調(diào)節(jié)糖和能量代謝，因此可將其作為治療肥胖的藥物靶點。膽汁酸是肝臟中類固醇氧化產(chǎn)生的類固醇分子家族，具有溶解脂肪、促進消化吸收的作用，也可引起細胞內(nèi)甲狀腺激素激活促進能量消耗。膽汁酸通過激活cAMP調(diào)節(jié)受體TGR5，從而下調(diào)ATP合成，cAMP水平升高可激活PKA磷酸化CREB轉(zhuǎn)錄因子，進而通過與啟動子上的CREs結(jié)合反式激活其靶基因，如D2的Dio2基因。在BAT中，D2的表達促進局部甲狀腺激素的生產(chǎn)，轉(zhuǎn)而增加能量消耗。WAT和BAT中其他參與能量消耗的基因在膽汁酸與受體結(jié)合后也被上調(diào)，這與前人研究報道結(jié)果一致。脂肪酸合成和氧化相關(guān)基因mRNA表達水平，在BAT增加，在WAT并無增加，說明BAT中TGR5的激活使這些基因mRNA表達水平的升高，引起能量的消耗及代謝的加速，并可通過抑制脂肪沉積導致體重下降，與單純高脂飼料喂飼的小鼠相比，OA（H）、CDCA及CA組小鼠體重明顯減少。此外，HE染色和油紅O染色病理觀察發(fā)現(xiàn)TGR5配體OA（H）、CDCA和CA具有顯著抑制高脂飲食后肝臟脂質(zhì)沉積和脂肪聚積的作用。

有研究認為TGR5不同的配體可能引發(fā)不同下游通路和基因表達譜，從而導致特定的結(jié)果產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，在沒有其他炎癥刺激，如LPS存在的條件下，以配體激活TGR5，可引起IL-1β和TNF-α表達上調(diào)，而且這種效應(yīng)不依賴于PKA的激活。在這種情況下，細胞因子的產(chǎn)生是通過激活JNK介導，進而上調(diào)miR-26a表達。這些結(jié)果表明，TGR5介導其生物學功能通過至少兩個不同的下游信號通路。

TGR 5激活的另一個效應(yīng)是促進胰高血糖素樣肽（glucagon-like peptide-1，GLP1）的分泌。GLP-1是腸促胰素家族的一員，可促進餐后腸內(nèi)分泌細胞分泌促胰島素，其主要作用是調(diào)節(jié)胰島素分泌。在本次研究中發(fā)現(xiàn)，與單純高脂飼料喂飼的小鼠相比，OA（H）、CDCA和CA組小鼠的血清胰島素水平明顯低于HF組小鼠，表明這些配體能夠移抑制高脂飲食引起的高胰島素血癥的發(fā)生。除了調(diào)節(jié)胰島素水平，TGR5激活也被證明能減少喂食高脂飼料小鼠的血糖水平。本研究中，與HF組小鼠相比，OA（H）、CDCA及CA組小鼠血糖水平顯著降低，提示TGR5天然配體能夠使血糖水平下調(diào)。這些結(jié)果表明，OA（H）、CDCA和CA激活TGR5能夠提高葡萄糖耐量，進一步證實了其潛在的治療代謝紊亂的作用。

如今，選篩出高效安全的TGR5配體用于藥物的研發(fā)迫在眉睫，許多研究也開始關(guān)注FXR的生理作用，F(xiàn)XR也是一種膽汁酸受體，激活后可用于治療代謝紊亂。然而，臨床前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR激活劑存在內(nèi)在毒性，并能改變一些基因表達譜，這進一步提示了充分研究膽汁酸激活信號網(wǎng)絡(luò)的必要性，以便篩選出最佳膽汁酸配體，為發(fā)展安全有效的藥物療法提供理論支持。

4結(jié)論

TGR5的激活可有效調(diào)節(jié)能量代謝，本研究通過建立后天肥胖小鼠模型，篩選了一些減肥效果較理想的TGR5配體，其中OA（H）、CDCA和CA可有效降低體重。CDCA和CA的干預(yù)能夠顯著降低胰島素水平，提示這些配體可作為抗肥胖藥，OA在高劑量下也能起到減肥作用，所以，對OA（H）、CDCA和CA的優(yōu)化可用于開發(fā)抗肥胖藥物。endprint