曾潔+華麗萍+黃彬+張玉琴+徐偉+林羽

摘要：目的 建立測定大鼠血漿中芍藥苷和芍藥內酯苷含量的高效液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）方法，并用于研究其在大鼠體內的藥動學特征。方法 采用HPLC-MS/MS方法，色譜柱為Ultimate RXB-C18（2.1 mm×100 mm，3 ?m），流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（30∶70，V/V），流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 ?L，檢測波長230 nm；定量離子對為：m/z 525→120.9（芍藥苷和芍藥內酯苷）、m/z 433→224.8（內標物梔子苷）。8只雄性SD大鼠，給予6 g原藥材/kg白芍湯灌胃，分別于0、5、10、20、30、45、60、90、120、180、360、540、720 min眼眶靜脈取血0.5 mL，測定血藥濃度，采用DAS V2.1.1藥動學軟件計算其主要藥動學參數(shù)。結果 芍藥苷和芍藥內酯苷分別在40～8000 ng/mL和40～10 000 ng/mL范圍內線性關系良好（r值分別為0.999 6和0.999 5），日內和日間精密度RSD均小于6%，提取回收率分別為92.33%～95.43%和88.65%～95.62%，基質效應分別為99.29%～107.86%和93.79%～104.05%，方法學考察均符合要求。主要藥動學參數(shù)：芍藥苷、芍藥內酯苷Cmax分別為（8.50±2.01）、（4.13±0.72）?g/mL，tmax分別為（10.00±1.73）、（20.00±2.11）min，t1/2分別為（142.98±30.11）、（127.68±35.74）min。結論 本研究所建立的HPLC-MS/MS方法簡單可行、準確可靠、靈敏度高、專屬性強，可應用于研究與分析芍藥內酯苷和芍藥苷在大鼠體內的藥動學特征。

關鍵詞：高效液相色譜-質譜聯(lián)用；芍藥苷；芍藥內酯苷；藥動學；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.020

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0089-06

Study on Content Determination and Pharmacokinetics of Paeoniflorin and Paeonolide

from Paeoniae Radix Alba in Rat Plasma

ZENG Jie1， HUA Li-ping2， HUANG Bin1， ZHANG Yu-qin2， XU Wei2， LIN Yu2

1. National-Local Joint Engineering Research Center of Rehabilitation Medicine Technology of Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China； 2. Pharmacy College of Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China

Abstract： Objective To establish a method for the content determination of paeoniflorin and paeonolide in rat plasma by HPLC-MS/MS； To study its characteristics of pharmacokinetics. Methods HPLC-MS/MS method was adopted. The column was Ultimate RXB-C18 （2.1 mm×100 mm， 3 ?m） with mobile phase consisted of acetonitrile- 0.1% formic acid water solution. Flow rate was 0.3 mL/min； column temperature was 30 ℃； the volume was 5 ?L； detection wavelength was 230 nm. Quantitative ions were m/z 525→120.9 （paeoniflorin and paeonolide）， m/z 433→224.8 （geniposide）. 8 SD male rats were collected blood 0.5 mL from orbital vein 0， 5， 10， 20， 30， 45， 60， 90， 120， 180， 360， 540， 720 min after intragastric administration Baishao Decoction 6 g （medicinal materials）/kg to determine the blood concentration of medicine. DAS V2.1.1 software was employed to calculate pharmacokinetic parameters. Results Good linearity was found in the range of 40–8000 ng/mL and 40–10 000 ng/mL for paeoniflorin and paeonolide （r=0.999 6， r=0.999 5）. The intra-day and inter-day RSD were less than 6%. The extraction recoveries were 92.33%–95.43% and 88.65%–95.62%. The matrix effect values were 99.29%–107.86% and 93.79%–104.05%.endprint

All items of method validation were in line with the requirements. The main pharmacokinetic parameters of paeoniflorin and paeonolide were showed as follows： Cmax of （8.50±2.01） and （4.13±0.72） ?g/mL； tmax of （10.00±1.73） and （20.00±2.11） min； t1/2 of （142.98±30.11） and （127.68±35.74） min. Conclusion The HPLC-MS/MS method established in this study is simple， feasible， accurate， reliable， highly sensitive， and specific， which can be applied to study the pharmacokinetic characteristics of paeoniflorin and paeonolide in rats in vivo.

Keywords： HPLC-MS/MS； paeoniflorin； paeonolide； pharmacokinetics； rats

白芍含有多種化學成分，具有多種藥理作用，其有效部位白芍總苷被開發(fā)為膠囊制劑（商品名為帕夫林），作為抗炎免疫調節(jié)藥應用于臨床[1]。芍藥苷和芍藥內酯苷為白芍中含量較高的2個活性成分（其中芍藥苷占白芍總苷的90%以上）[2]。芍藥內酯苷具有抗癲癇、鎮(zhèn)痛、解毒及止眩暈等作用[3]，芍藥苷具有神經(jīng)保護、生血和擴張血管等作用[4]。

有關芍藥苷和芍藥內酯苷的藥動學研究已有較多文獻報道，但研究主要著重于單體化合物[5-7]，以中藥煎煮方式制備并觀察給藥后其體內藥動學研究較少。本研究以芍藥苷和芍藥內酯苷為白芍代表性有效成分，建立高效液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）測定灌胃給藥白芍煎煮液后大鼠血漿中芍藥苷和芍藥內酯苷含量的方法，闡明其藥動學特征。

1 儀器、試藥與動物

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Agilent 6410三重四級桿質譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），微型渦旋混合儀（其林貝爾儀器制造有限公司，VORTEX-5），高速離心機（美國貝克曼，Microfuge 22R），微量移液器（德國Eppendorf公司），十萬分之一天平（METTLER TOLEDO）。

芍藥苷對照品（批號110736-201033，純度95.7%），中國食品藥品檢定研究院；芍藥內酯苷對照品（批號39011-90-0，純度98%），成都曼思特生物科技有限公司；梔子苷對照品（批號110749-201127，純度97.5%），中國食品藥品檢定研究院。白芍飲片（批號20120808），福州回春中藥飲片廠有限公司。乙腈（色譜純，美國默克公司），甲酸（色譜純，德國Merck公司），其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

8周齡清潔級健康SD雄性大鼠24只，體質量（280±20）g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房。

2 方法與結果

2.1 液相色譜及質譜條件

液相色譜條件：色譜柱為Ultimate RXB-C18（2.1 mm×100 mm，3 ?m），檢測波長230 nm，流動相為乙腈-0.1%甲酸水（30∶70，V/V），等度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 ?L。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），干燥氣體為N2（純度99.9%），干燥氣流量15 L/min，負離子檢測模式，毛細管電壓2.5 kV，離子源溫度350 ℃，采集方式為多反應監(jiān)測（MRM），定量離子對為m/z 525→120.9（芍藥內酯苷和芍藥苷）、m/z 433→224.8（內標物梔子苷）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 白芍湯制備

稱取白芍飲片，10倍量水煎煮2次，每次1.5 h，過濾，合并2次藥液，減壓濃縮藥液并用超純水定容至1 g原藥材/mL，供動物實驗用。

2.2.2 對照品溶液及內標溶液的制備

精密稱定適量對照品芍藥苷和芍藥內酯苷，加入甲醇，分別制得濃度為800 ?g/mL的對照品母液。另取一50 mL量瓶，移取上述對照品母液各1 mL，加入甲醇定容至刻度，即得含有16 ?g/mL芍藥苷和芍藥內酯苷的混合對照品貯備液。稀釋得所需不同濃度的芍藥苷和芍藥內酯苷的混合對照品溶液。精密稱定梔子苷適量，加入甲醇，定容得3 mg/mL的內標母液，稀釋得濃度為30 ?g/mL的梔子苷溶液。上述溶液均置于4 ℃冰箱保存。

2.2.3 血漿樣品的制備

大鼠隨機分為給藥組、對照組與空白組，每組8只。給藥組大鼠實驗前禁食12 h，自由飲水，按6 g/（kg·d）劑量灌胃給藥；對照組和空白組給予等劑量生理鹽水灌胃。給藥組大鼠于灌胃后5、10、20、30、60、90、120、180、360、540、720 min眼眶靜脈取血0.5 mL并立即移入經(jīng)肝素處理的離心試管中，靜置5 min，4000 r/min離心10 min，分別取血漿，置于-20 ℃冰箱中保存待測。對照組與空白組大鼠于灌胃后5 min取血，離心后得空白血漿，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

各組分別取50 ?L血漿，加50 ?L內標物（30 ?g/mL梔子苷甲醇溶液），給藥組和空白組加入100 ?L純甲醇，對照組分別加入“2.2.1”項下不同濃度的混合對照品溶液100 ?L（配制成不同濃度芍藥內酯苷、芍藥苷的血漿質控樣品），渦旋2 min，以12 000 r/min離心10 min沉淀蛋白后，取上清液150 ?L，放入1.5 mL EP管內，減壓離心濃縮儀濃縮，溫度調至45 ℃左右。揮干后，各組樣品用150 ?L純甲醇復溶，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）15 min，17 000 r/min離心10 min，移出100 ?L于全回收進樣瓶中，供HPLC-MS/MS分析。endprint

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗

分別取空白組、對照組和給藥組血漿樣品（給藥后10 h），進樣測定，HPLC-MS/MS圖見圖1，表明血漿中的內源性物質不干擾測定。

2.3.2 線性范圍考察與最低定量限

取對照組大鼠血漿，按“2.2.3”項下方法配制成相當于芍藥苷、芍藥內酯苷血漿濃度為0.04、0.08、1、2、4、8 ?g/mL的血漿樣品，進樣5 ?L，記錄色譜圖。分別以芍藥內酯苷、芍藥苷的待測血漿濃度為橫坐標，以待測峰面積與內標物質的峰面積比值為縱坐標，采用加權最小二乘法求得直線回歸方程，并計算最低定量限，結果見表1。

2.3.3 精密度和標準曲線準確度試驗

取沉淀蛋白后的空白組大鼠血漿50 ?L，分別制備芍藥苷、芍藥內酯苷低、中、高3個濃度的質量控制（quality control，QC）樣品和隨行的標準曲線，按“2.2.3”項下方法操作，進樣5 ?L，記錄色譜圖。每批每個濃度平行制備6份樣品，分3 d重復測定3批，并與標準曲線同時進行。用隨行的標準曲線計算各QC樣品的濃度，經(jīng)方差分析求得本法的精密度；并用QC樣品濃度的測定值與理論值的百分比表示準確度，結果見表2。結果表明，所建立的測定血漿中芍藥苷、芍藥內酯苷濃度的分析方法符合要求，可用于體內測定。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取空白組大鼠血漿，沉淀蛋白后，吸取上清液，制備得芍藥苷和芍藥內酯苷濃度為0.1、2、8 ?g/mL的低、中、高3個濃度的QC樣品，每個濃度樣品平行制備6份，分別在室溫和4 ℃環(huán)境下放置24 h、反復凍融3次（-80 ℃冷凍，室溫解凍），考察樣品的穩(wěn)定性，之后按“2.2.3”項下方法操作，進樣測定峰面積，與當日所制備標準曲線計算值之比為結果，見表3。結果表明，芍藥苷和芍藥內酯苷在上述環(huán)境下RSD均小于6%，穩(wěn)定性良好。

2.3.5 提取回收率及基質效應

取經(jīng)沉淀蛋白后的空白組大鼠血漿150 ?L，加入等體積不同濃度的芍藥苷和芍藥內酯苷混合對照品溶液，按“2.2.3”項下方法操作，揮干后150 ?L甲醇復溶、離心，制成濃度分別為0.1、2、8 ?g/mL的低、中、高3個濃度的QC樣品，每個濃度平行制備6份樣品，進樣，得峰面積A，相同質量濃度的對照品溶液進樣測定得峰面積B?；|效應（%）=（A/B）×100%。取對照組大鼠血漿，按“2.2.3”項下方法制備芍藥苷和芍藥內酯苷濃度為0.1、2、8 ?g/mL的低、中、高3個濃度的QC樣品，進樣測定，得峰面積C。提取回收率（%）=（C/A）×100%。結果見表4。結果表明，芍藥苷和芍藥內酯苷不存在明顯的基質效應（芍藥苷為93.79%～104.05%，芍藥內酯苷為99.29%～107.86%，RSD均小于9%），提取回收率符合要求（芍藥苷為88.65%～95.62%，芍藥內酯苷為92.33%～95.43 %，RSD均小于12%）。

2.4 大鼠體內藥動學研究

SD雄性大鼠8只，灌胃給藥前禁食12 h，自由飲水。按6 g/（kg·d）劑量灌胃給藥，灌胃后5、10、20、30、60、90、120、180、360、540、720 min眼眶靜脈取血0.5 mL，采集大鼠血漿，用經(jīng)方法學驗證的HPLC-MS/MS方法定量分析血漿中芍藥苷和芍藥內酯苷的濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，結果見圖2、圖3。采用DAS V2.1.1藥動學軟件計算其主要藥動學參數(shù)，結果見表5。芍藥苷和芍藥內酯苷在大鼠體內的血藥濃度達峰時間tmax分別為10.00、20.00 min，半衰期t1/2z分別為142.98、127.68 min。表明芍藥苷和芍藥內酯苷在大鼠體內的吸收和消除速率均較快。

3 討論

本研究旨在探討芍藥苷和芍藥內酯苷這2種白芍專屬化學成分在大鼠體內的藥動學性質，精確闡述這2種指標成分的體內代謝過程，從而為白芍的進一步臨床應用提供實驗依據(jù)。為了更加接近傳統(tǒng)中藥方劑的用藥習慣，本試驗采用煎煮法對白芍飲片進行提取，提取溶劑選擇水，并用干擾雜質更少的超純水代替一般用水。

血漿樣品前處理中，選擇去除血漿蛋白方式時，由于芍藥苷和芍藥內酯苷同為水溶性物質，極性較大，因此，如果采用液-液萃取的方式除去蛋白，芍藥苷和芍藥內酯苷的提取率較低。由于眼眶靜脈取血單次取血量少（0.5 mL），故不適合使用固相萃取柱凈化法去除血漿蛋白。最終，本研究采用操作簡單的有機溶劑沉淀法，分別考察了甲醇和乙腈2種蛋白沉淀劑，結果表明，甲醇較乙腈更能均勻去除血漿蛋白，色譜響應較高，因此選用甲醇沉淀血漿蛋白。

選擇流動相和質譜條件時，由于芍藥苷與芍藥內酯苷的母離子和子離子完全一樣，如果色譜上未能完全分離，則會影響后續(xù)的質譜檢測，因此，本研究對液相色譜中流動相進行了考察。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，甲醇體系分離度較乙腈體系差，并且存在色譜峰拖尾造成的不對稱問題，加入一定量的甲酸能夠改善其峰形。因此，最終選擇乙腈-0.1%甲醇作為流動相，其分離度較甲醇體系好，質譜響應也明顯優(yōu)于乙腈-水體系。針對芍藥苷和芍藥內酯苷的化學結構和理化性質，負離子檢測模式更能提高化合物的響應，此外再采用MRM模式。由于四級桿質譜分子量偏差一般較大，故本研究通過對所分析化合物的碰撞裂解碎片推測分析，采用Masslynx V4.1的精確分子量工具計算，最終確定待測物的質譜條件。

大鼠灌胃給藥白芍湯后，芍藥苷和芍藥內酯苷在大鼠體內的消除過程均屬于一級消除，藥動學模型符合二室模型要求。觀察其藥動學參數(shù)可知，芍藥苷和芍藥內酯苷的表觀分布容積/絕對生物利用度（Vz/F）均大于SD大鼠體液體積（0.6～0.7 L/kg），這與弱堿性藥物分布容積較大的特點一致。芍藥苷的tmax為（10.00±1.73）min，t1/2為（142.98±30.11）min；芍藥內酯苷的tmax為（20.00±2.11）min，t1/2為（127.68±35.74）min。表明芍藥苷和芍藥內酯苷在大鼠體內能夠被迅速吸收，達到峰濃度后也能夠迅速消除。白芍湯灌胃給藥吸收速度快，同時吸收程度較低，提示芍藥苷和芍藥內酯苷可能主要經(jīng)上消化道吸收，對白芍相關制劑的開發(fā)和給藥途徑的選擇具有一定的指導意義。與同類型文獻相比，其達峰時間較快、末端消除半衰期則有所延長[8-10]，這種差異可能是由灌胃劑量的不同或藥物的配伍作用引起的；但與一些復方制劑的藥動學研究[11-12]相比，發(fā)現(xiàn)白芍與其他中藥配伍（如當歸、甘草）可以顯著增加芍藥苷和芍藥內酯苷的達峰時間以及末端消除半衰期，延長其在體內的滯留時間。另外，本研究中，芍藥苷和芍藥內酯苷的藥物濃度-時間曲線均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。導致雙峰的原因很多，如肝腸循環(huán)和其他循環(huán)過程（胃-腸循環(huán)、腸-腸循環(huán)等）或者胃排空延遲、藥物在腸段不同部位吸收的差異等。關于芍藥苷、芍藥內酯苷出現(xiàn)雙峰的具體原因需要進一步研究。endprint

本研究建立了同時檢測大鼠血漿中芍藥苷和芍藥內酯苷的HPLC-MS/MS方法，該方法靈敏度高、專屬性強、準確可靠，可應用于研究與分析芍藥內酯苷和芍藥苷在大鼠體內的藥動學特征，具有較好的臨床應用價值。

致謝：本課題在福建中醫(yī)藥大學康復技術協(xié)同創(chuàng)新中心和國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復研究中心資助下完成。

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