摘要：指出了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是目前的一種最基本也是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。由于PCR反應(yīng)的快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)使其在短短的數(shù)年時(shí)間即被廣泛應(yīng)用于各大領(lǐng)域。介紹了PCR反應(yīng)的原理以及常用的PCR反應(yīng)技術(shù)，探討了該技術(shù)在醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)業(yè)中的運(yùn)用，以期提供參考。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);技術(shù);應(yīng)用

中圖分類號：TS907

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：16r 4-9944（2018）8-0230-02

1 引言

20世紀(jì)80年代中期，Mullis發(fā)明了體外核酸擴(kuò)增技術(shù)——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱PCR（ PolymeraseChain Reaction）反應(yīng)。PCR反應(yīng)是一種在生物體外模擬生物體內(nèi)復(fù)制進(jìn)行特定的DNA片段的放大擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR反應(yīng)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、易重復(fù)、簡便、快速等突出優(yōu)點(diǎn)使其在短短的數(shù)年時(shí)間即被廣泛應(yīng)用于各大領(lǐng)域如醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品行業(yè)、農(nóng)業(yè)、基因工程等。筆者將從PCR反應(yīng)的原理、技術(shù)及應(yīng)用方面進(jìn)行綜述。

2 PCR反應(yīng)的原理

DNA的半保留復(fù)制，具有高度的保真性，保證親代DNA和了代DNA具有相同的遺傳信息，為維持物種的穩(wěn)定性和連續(xù)性起著非常重要的作用。PCR反應(yīng)的基本原理就是模擬DNA的體內(nèi)復(fù)制過程進(jìn)行DNA的體外擴(kuò)增，通過設(shè)計(jì)特異性引物快速擴(kuò)增所需的目的DNA序列。該技術(shù)是在模板DNA、dNTP mix、特異性引物、耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）和含Mg2+的緩沖液存在下的酶促反應(yīng)，反應(yīng)需在PCR儀中完成。PCR反應(yīng)通常由變性、退火、延伸3個(gè)階段構(gòu)成：①變性。酶促反應(yīng)體系的溫度加熱至90～95℃，模板DNA雙鏈變性解離成單鏈DNA;②退火。溫度降至50～55℃，引物與單鏈DNA結(jié)合，形成局部雙鏈;③延伸。反應(yīng)體系的溫度升高至72℃，以dNTP為原料，經(jīng)熱穩(wěn)定的Taq酶的催化，合成一條與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。變性、退火、延伸這3個(gè)步驟就構(gòu)成了PCR的一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過大概30個(gè)循壞。就可以將待擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增數(shù)百萬倍以上。

3 常用的PCR反應(yīng)技術(shù)

3.1 定量PCR技術(shù)

定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進(jìn)行PCR起始模板量的定量[1]。目前，采用定量PCR方法主要包括半定量PCR、熒光定量PCR、定時(shí)定量PCR等。比如，可以借助半定量PCR技術(shù)分析目的基因在植物或者動(dòng)物的不同組織和發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況，判斷該基因是組織特異性基因還是組成型基因，為基因功能的預(yù)測提供一定的基礎(chǔ)。

3.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)

RT - PCR技術(shù)，將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）二者相結(jié)合在一起。以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶的催化合成cDNA，再以cD-NA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。RT - PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于克隆mRNA的3和5的末端序列獲得基因的全場序列、檢測細(xì)胞或者組織中基因表達(dá)水平、測定細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等[2]。

3.3 巢式PCR技術(shù)

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），區(qū)別于一般的PCR反應(yīng)。它使用兩對PCR引物通過兩輪PCR反應(yīng)（Outcr PCR和Inner PCR）擴(kuò)增特異性的DNA片段。其中，第一對引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似，其擴(kuò)增的產(chǎn)物為第二輪Inner PCR的模板。第二對引物為巢式引物，結(jié)合在第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二輪Inner PCR擴(kuò)增片段小于第一次擴(kuò)增。例如，利用巢式PCR技術(shù)可以快速檢測到病料中的豬瘟病毒，在豬瘟的早期檢測及預(yù)防、控制上起到重要的作用[3]。

3.4 原位PCR技術(shù)

原位PCR技術(shù)是在原位雜交和PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)。原位PCR技術(shù)可在組織切片或組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而在細(xì)胞和分子水平上檢測到特定的基因序列，具有高度特異性、高度的敏感性和細(xì)胞定位準(zhǔn)確的能力[4]。比如，在病理學(xué)領(lǐng)域，原位PCR技術(shù)不僅可以用于檢測細(xì)胞或者微生物病原的核酸，還可用于分析腫瘤、遺傳性疾病等內(nèi)源基因的變化，以及跟蹤疾病與治療過程帶來的基因組改變，在分子水平上闡述疾病發(fā)生發(fā)展與致病因子之間的相互作用，在病理學(xué)研究與診斷中得到越來越廣泛的應(yīng)用[5]。

3.5 多重PCR技術(shù)

多重PCR在同一個(gè)PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入了兩對或兩對以上的寡核苷酸引物，并且同時(shí)能擴(kuò)增出數(shù)量較多的核酸片段的PCR，其反應(yīng)原理和操作過程一般與其他PCR相同[6]。

4 PCR反應(yīng)技術(shù)的應(yīng)用

4.1

PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

PCR技術(shù)由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，對腫瘤、遺傳病和感染性疾病的早期診斷，指導(dǎo)臨床治療和病情的觀察具有非常重要的意義。

4.1.1

Bart'S胎兒水腫綜合征

胎兒由于缺乏a珠蛋白基因表達(dá)，宮內(nèi)嚴(yán)重貧血，多于孕晚期或出生后很快死亡。這種缺失型綜合征可用PCR鑒定基因擴(kuò)增產(chǎn)物的有無進(jìn)行基因的診斷，對Hb Bart's水腫胎早期流產(chǎn)，是重要預(yù)防出生缺陷的措施[7]。

4.1.2 甲型肝炎的診斷與預(yù)防

通過PCR技術(shù)擴(kuò)增患者血液、尿液中甲型肝炎病毒（ HAV）特異性基因片段（HAV- RNA）來作為HAV鑒定和檢測診斷手段，能有效對甲型肝炎進(jìn)行早期診斷以及預(yù)防其傳播流行。

4.2

PCR技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用

民以食為天，健康、放心、安全的食品是每一個(gè)人心中的夢想。傳統(tǒng)食品中微生物致病菌的檢測的步驟繁瑣費(fèi)時(shí)，并對那些難以人工培養(yǎng)的微生物無法檢測。PCR技術(shù)剛好可以解決傳統(tǒng)微生物檢測所面臨的難題，檢測人員可以借助PCR反應(yīng)檢測食品中的沙氏門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，讓人們的食品更加安全。

4.3

PCR技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

近年來隨著PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，對大氣、土壤、水等方面的環(huán)境監(jiān)測發(fā)揮著越來越重要的作用。譬如，用熒光定量PCR技術(shù)檢測環(huán)境激素一二惡英，其結(jié)果與其他生物學(xué)方法高度一致，并且靈敏、快速、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)可作為大量污染點(diǎn)和基層單位進(jìn)行二惡英樣本的預(yù)篩手段[8]。

4.4

PCR技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在農(nóng)業(yè)中也有有非常廣泛的應(yīng)用如轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測、作物的遺傳育種。植物從萌發(fā)到衰老整個(gè)生命周期除了可以看到的外在的因素的影響，電受到內(nèi)在的因素基因的調(diào)控。研究整個(gè)周期過程基因表達(dá)的變化是揭示生長發(fā)育機(jī)理的重要手段。定量RTPCR是研究植物基因表達(dá)水平變化的一項(xiàng)重要技術(shù)。譬如，為了減少秋季低溫使得霜期提前，影響棉花的產(chǎn)量和晶質(zhì)，人類一直在積極探索能夠促進(jìn)植物早花的分子機(jī)理與機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)從棉花中克隆了一個(gè)成花素類似基因GhFTL1，通過對其功能進(jìn)行初步分析，在擬南芥中組成型表達(dá)GhFTLl時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥開花比野生型明顯提早，為借助基因工程手段調(diào)控棉花的開花時(shí)間具有重要的理論指導(dǎo)意義[9]。

5 結(jié)論

隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)也在不斷創(chuàng)新與完善，它將滲透到生活的各個(gè)領(lǐng)域，人類將在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、基因工程方而取得更大的突破！

參考文獻(xiàn)：

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6]趙紅慶，宛錫銅，黃留玉，多重PCR技術(shù)在病原檢測中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊，2008，18（9）：863～865.

[7]張金云，黃振勇，譚衛(wèi)荷，等.產(chǎn)前診斷——THAI型相關(guān)HbBart's水腫胎的臨床研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2017，25（5）：85～86。

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