倪黎綱+趙旭庭+王宵燕+劉鶴鳴+陳章言

摘要：通過冷PBS氣管灌洗法分離培養(yǎng)姜曲海豬肺泡巨噬細胞（PAM），進行了PAM純度鑒定、細胞吞噬功能和存活率檢測。從健康20日齡仔豬，分離得到PAM。以10% RPMI-1640培養(yǎng)液對PAM進行培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)，用墨汁吞噬和免疫熒光檢測了PAM的吞噬功能和純度，比較凍存前和復(fù)蘇后細胞的活率和細胞吞噬功能，以獲得一批高純度的PAM，用于豬體外呼吸道疾病發(fā)病機理的研究。

關(guān)鍵詞：豬肺泡巨噬細胞（PAM）；分離；培養(yǎng)；鑒定

中圖分類號： S858.286.3文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0163-03

通信作者：趙旭庭，碩士，教授，研究方向為地方畜禽遺傳資源的保護與利用。E-mail：825587062@qq.com。肺泡巨噬細胞是機體抵御外來微生物侵襲肺臟的第一道防線，一直是研究肺部抗感染模型的重要細胞類型[1]。豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolar macrophages，PAM）是豬肺臟重要的功能細胞，它不僅可吞噬侵入肺臟的粒子，參與肺臟的防御和免疫，而且還能分泌大量的生物活性物質(zhì)，維持肺臟和機體正常的生理活動[2]。目前，肺泡巨噬細胞的分離培養(yǎng)以小動物，如大鼠、小鼠、豚鼠居多，國內(nèi)關(guān)于豬肺泡巨噬細胞的分離培養(yǎng)方法的報道很少。豬肺泡巨噬細胞屬于不繁殖細胞群，為多代培養(yǎng)，難以在體外長期生存[3]。隨著體外分離細胞技術(shù)的不斷發(fā)展，巨噬細胞的提取方法有多種，又由于研究目的不同，在體內(nèi)提取細胞的部位也不盡相同[4-5]，巨噬細胞在肝、腦等實質(zhì)器官以及腹腔等空腹部位以不同的形式分布，不少文獻報道從多種組織器官中分離和純化巨噬細胞[6]。為獲得存活率高，純度高，吞噬功能強的PAM，并節(jié)約試驗材料、減少因細胞來源不同造成的試驗誤差，本試驗對地方豬姜曲海豬PAM進行了分離、純化、鑒定和冷凍保存，探索PAM生長和凋亡周期，觀察生長過程中形態(tài)和吞噬能力的變化。為利用PAM在體外研究地方豬呼吸道疾病及其他肺部疾病的治病機理探究等奠定基礎(chǔ)。

1試驗方法

1.1試驗材料

20日齡健康姜曲海豬由江蘇姜曲海種豬場提供。

1.2試驗試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清FBS為Giboc公司產(chǎn)品，DMSO為國產(chǎn)試劑，1 ∶100稀釋的小鼠源抗MAC387單抗（abcam，ab22506），1 ∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（Bioworld）。

1.3試劑的配制

RPMI-1640完全培養(yǎng)液：RPMI-1640培養(yǎng)液，10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（PS）、1%非必需氨基酸（NEAA）、1%丙酮酸；細胞凍存液：70% RPMI-1640培養(yǎng)基，20% FBS，10% DMSO；墨汁：4.5 mL PBS加入0.5 mL墨汁，均勻混合后高壓滅菌。

1.4試驗方法

1.4.1PAM的分離將試驗仔豬置于無菌室內(nèi)解剖臺上，采取股動脈放血致死，剖開胸腔，小心剝離并結(jié)扎氣管后連同心臟取出完整的肺臟，用PBS充分清洗肺臟表面，清洗血塊污垢，從氣管往肺臟注入雙抗PBS 50～100 mL，輕輕拍打表面，1～2 min后回收支氣管肺泡灌洗液，重復(fù)灌洗2～3次，直到共回收200 mL灌洗液，將灌洗液經(jīng)4層無菌紗布過濾，去除脂肪組織塊等。1 000 r/min離心10min，倒掉上清，用PBS重懸細胞，重復(fù)洗滌2次，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌1次，離心去上清，得到肺泡巨噬細胞。

1.4.2原代PAM的培養(yǎng)用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至2×106個/mL，吸取2 mL鋪于6孔板，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2 h后從細胞培養(yǎng)箱中取出細胞板，棄掉舊培養(yǎng)液，用PBS輕輕潤洗2次，加入新的RPMI1640完全培養(yǎng)液。以后每24 h更換1次新鮮培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)20 d，觀察記錄細胞培養(yǎng)的全過程。

1.4.3PAM存活率和純度鑒定

1.4.3.1臺盼藍染色檢測PAM細胞的存活率將0.4%的臺盼藍染液與等體積的細胞懸液混合，染色2～3 min，取1滴混合液加入細胞計數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下計數(shù)著藍色和未著色的細胞。計算細胞存活率，細胞存活率=未著色細胞數(shù)/（著色細胞數(shù)+未著細胞數(shù)）×100%[1]。

1.4.3.2免疫熒光法檢測PAM吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入4%多聚甲醛固定30 min，經(jīng)0.2% Triton-100穿透20 min后，用PBS清洗3次，每次5 min，加入一抗（1 ∶100 稀釋的小鼠源抗MAC387單抗），室溫孵育2 h，加入二抗（1 ∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG），室溫孵育1 h后，加入終濃度為10 μg/L的Hoechst33342，室溫染色3～5 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。試驗每一步均需用PBS充分洗滌。

1.4.4PAM的冷凍保存與復(fù)蘇

1.4.4.1細胞凍存將培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)液棄掉，用PBS沖洗2遍后，加入0.25%胰酶消化4 min后加入完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，用移液器輕輕吹吸使細胞脫落，將細胞懸液移至15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清。將 4 ℃ 預(yù)冷的凍存液加入15 mL離心管中，輕輕吹打，使細胞重懸于凍存液中，將細胞懸液分裝于細胞凍存管中，1 mL/管，標(biāo)記細胞名稱和凍存日期。放入4 ℃預(yù)冷的程序降溫盒中，將程序降溫盒放至-70 ℃，第2天移至液氮中保存。

1.4.4.2細胞復(fù)蘇從液氮中取出凍存管，迅速放到37 ℃水浴箱中搖晃至解凍，完全解凍后，加入2 mL完全培養(yǎng)基，混勻后1 500 r/min離心5 min。離心后棄去上清，加入4 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液鋪至新的細胞培養(yǎng)皿中，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。endprint

1.4.4.3墨汁吞噬試驗將PAM接種至24孔板，接種的細胞量為1×105個/孔，細胞培養(yǎng)2 h后，每孔加入1 mL墨汁，對照組加入等量的PBS，每組3個平行樣。16 h后更換新鮮的培養(yǎng)液，隨機選擇5個視野，每個視野觀察200個細胞，單個視野的墨汁吞噬率=吞噬墨汁的細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，所有視野的平均值即為墨汁吞噬百分率。

2結(jié)果與分析

2.1分離培養(yǎng)細胞3周內(nèi)的形態(tài)學(xué)觀察

從豬肺泡里分離出來的巨噬細胞大多呈圓形或者橢圓形，細胞大小不一，培養(yǎng)2 h后洗去未貼壁的細胞，加入新鮮培養(yǎng)液，PAM細胞達到純化、成圓形，繼續(xù)培養(yǎng)至有偽足和突出生出，細胞活力較好。培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下可見細胞貼壁生長，體積逐漸增大，有橢圓形、長梭形和不規(guī)則的形態(tài)，胞漿豐富。從3 d開始細胞周邊或者兩極可見伸展的偽足。培養(yǎng)4 d，細胞生長依然良好。7～8 d，細胞開始出現(xiàn)萎縮，貼壁細胞逐漸減少，生長狀態(tài)較差，懸浮于培養(yǎng)液中，細胞開始死亡。14 d左右細胞大量死亡（圖1）。20 d左右細胞全部死亡。

2.2原代PAM存活率與純度鑒定

體外分離得到原代PAM后，用臺盼藍染色檢測其存活率，結(jié)果顯示活率較高，約為99.50%。用間接免疫熒光檢測PAM的純度，即用免疫熒光法對純化后BALF細胞中PAM進行鑒定，純度約為94.70%（圖2）。

2.3細胞冷凍復(fù)蘇對PAM存活率和吞噬功能的影響

2.3.1冷凍和復(fù)蘇對PAM存活率的影響細胞凍存時細胞密度為1.51×107個/mL，復(fù)蘇后，細胞密度為1.48×107個/mL，細胞的存活率較高，為98.01%（圖3）。

2.3.2冷凍和復(fù)蘇對PAM吞噬功能的影響豬肺泡巨噬細胞的墨汁吞噬檢測試驗發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)中有大量的墨汁顆粒，胞核形態(tài)不規(guī)則并有明顯扭曲折疊，細胞吞噬試驗結(jié)果顯示墨汁吞噬率很高，冷凍前吞噬率約為92.00%，復(fù)蘇后吞噬率約為 93.10%（圖4），表明巨噬細胞對墨汁顆粒有很強的吞噬作用，并且冷凍保存和復(fù)蘇對細胞的吞噬功能影響不大，復(fù)蘇后的細胞吞噬功能略大于冷凍前（P>0.05）。

3討論與結(jié)論

豬肺泡巨噬細胞屬于不繁殖細胞群，難以在體外長期生存，多做原代培養(yǎng)，因此將豬肺泡巨噬細胞進行體外分離、純

化、冷凍保存非常重要。預(yù)冷PBS灌洗法獲得BALF是目前分離PAM通常采用的方法[3]，該方法獲取的細胞超過90%是貼壁細胞為PAM。由BALF回收的細胞中除了PAM外，還有T、B淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞等細胞，雜細胞的存在會影響試驗效果，本試驗中利用貼壁速度的不同，培養(yǎng)2 h后換液去除未貼壁的細胞獲得了高純度的PAM。用免疫熒光法對巨噬細胞特異性表達標(biāo)記的MAC387進行檢測，試驗結(jié)果表明本試驗中獲得的PAM純度較高。分離培養(yǎng)得到的PAM純度越高，越有利于后續(xù)相關(guān)試驗的進行。

巨噬細胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，吞噬、清除和呈遞抗原異物的功能是其基本生物學(xué)功能和維持正常生理狀態(tài)所必需的。PAM對細菌和異物的吞噬作用，測定其吞噬功能，可作為機體免疫功能的一種指標(biāo)，墨汁吞噬試驗是檢測AM功能的一種簡便易行的方法[1]。本試驗檢測了分離培養(yǎng)16 h和復(fù)蘇后巨噬細胞的墨汁吞噬率，得出復(fù)蘇后細胞吞噬能力略微提高，但是差異不顯著，與前人的試驗結(jié)果基本一致。

原代培養(yǎng)的PAM存在增殖速度慢、難以傳代和在體外長期生存的問題，但為節(jié)約試驗動物成本和獲得均一的用于體外試驗的PAM，需要將同批次的PAM細胞進行凍存。本試驗中采用的凍存液和凍存方法較為合適，70%的RPMI-1640，20%胎牛血清和10% DMSO配制成凍存液凍，并用 4 ℃ 預(yù)冷的程序降溫盒凍存細胞，過夜后轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存，復(fù)蘇后細胞的存活率在97%以上，可以用于PAM的冷凍與保存。

綜上所述，本試驗進行了PAM的分離、純化、鑒定及冷凍保存，獲得了一批純度較高，吞噬能力較強的PAM。本試驗分離得到的PAM可以用于體外研究豬呼吸道疾病及其他肺部疾病的治病機理探究等奠定基礎(chǔ)。

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