張紅霞 李加恒

微生物限度檢查法是評價生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)，其檢驗項目包括染菌量及控制菌的檢查[1]。2015年版《中國藥典》規(guī)定供試品染菌量的檢查“按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定[2]”、供試品控制菌檢查中的增菌培養(yǎng)過程需要“經(jīng)方法適用性試驗確定[3]”，凡是進行藥品的微生物限度檢查，都需要一套要求更高的真實、完整、規(guī)范的該藥品的微生物限度檢查方法適用性試驗資料。筆者在2016—2017年監(jiān)督及復(fù)核檢驗過程中，共收集了112份試驗資料，在羅書香[4]等人進行微生物限度檢查驗證資料分析過后，這112份試驗資料在內(nèi)容完整性、規(guī)范性及嚴謹性等方面仍存在較多問題。為了以后微生物限度檢查的順利進行，本文就所收集到的試驗資料中存在的主要問題進行統(tǒng)計和分析，以期在節(jié)約人力物力的基礎(chǔ)上，保證最終檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 存在的問題

1.1 內(nèi)容不完整

無藥品生產(chǎn)廠家信息者4個，占3.6%；無試驗單位信息者和無公章者各6個，占10.8%；無試驗單位聯(lián)系方式者83個，占74.1%；試驗資料未編號者36個，占32.1%。

1.2 檢品信息不完整

未提供檢品信息者和批號者各2個，占3.6%；未提供檢品包裝信息者33個，占29.5%；未提供批準(zhǔn)文號者12個，占22.3%；未提供檢品規(guī)格者8個，占7.1%。

1.3 存在的較多問題

無處方來源或主要成份者109個，占97.3%；無制劑方法者110個，占98.2%；無檢驗依據(jù)者74個，占66.1%；無實驗室環(huán)境潔凈度記錄者111個，占99.1%；未提供試驗儀器信息者11個，占9.8%；試驗儀器無編碼者106個，占94.6%；無校驗記錄者94個，占83.9%。

1.4 培養(yǎng)基信息存在的問題

無信息者5個，占4.5%；無適用性檢查者19個，占17.0%；培養(yǎng)基信息不全者5個，占4.5%。

1.5 菌種資料不完整

無信息者2個，占1.8%；無菌種來源者20個，占17.9%；未提供菌種代數(shù)者6個，占5.4%；無菌落確認試驗者和選擇菌種錯誤者各7個，占12.6%。

1.6 計數(shù)方法適用性試驗存在的問題

未提供方法者6個，占5.4%；方法少陰性對照者28個，占25.0%；方法選擇錯誤者1個，占0.9%；無培養(yǎng)時間者10個，占8.9%；培養(yǎng)時間超過規(guī)定者和無培養(yǎng)記錄者各4個，占7.2%；未按照計數(shù)方法規(guī)定“所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%”者7個，占6.3%；無回收率結(jié)果者1個，占0.9%。

1.7 其他問題

試驗過程中未做供試液對照組有80個，占71.4%，其中未提供中和劑對照組結(jié)果者9個，占8.0%；試驗次數(shù)不夠者57個，占50.94%：其中控制菌檢查方法適用性試驗僅提供1次試驗結(jié)果有40個，占35.7%；試驗結(jié)果與結(jié)論不一致者5個（如金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌試驗結(jié)果列表顯示為“24%、31%、20%”和“15%、16%、14%”，而結(jié)論卻為“回收率高于70%”），占4.5%；試驗過程表述不完善者16個（如取供試液，采用0.5 ml試驗等類似表述），占14.3%；試驗用語不準(zhǔn)確者102個（例如“適用性試驗”寫成“驗證試驗”、菌落形成單位誤寫成“CFU/g”），占91.1%；試驗中所用培養(yǎng)基具體多少量不清楚者14個（如“取不少于100 ml的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基”等），占12.5%；無結(jié)論或結(jié)論不全者14個，占12.5%；藥品微生物限度檢查方法適用性試驗資料中仍存在“胰酪大豆胨瓊脂”錯寫成“胰絡(luò)大豆胨瓊脂”的情況，甚至有1份資料存在僅有不完整結(jié)論的現(xiàn)象。

2 討論

2.1 資料信息

藥品生產(chǎn)企業(yè)的名稱及聯(lián)系方式是表明藥品質(zhì)量和安全的重要內(nèi)容，同品種藥品不同的生產(chǎn)企業(yè)由于各方面的差異，微生物限度檢查適用性試驗方法很可能存在較大不同；驗證單位信息的重要性更是不言而喻，它是各試驗及復(fù)驗單位的技術(shù)人員對相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)理解及操作步驟具體實施等內(nèi)容商討的重要途徑。

2.2 檢品信息

待測樣品信息通常應(yīng)包括檢品名稱、批準(zhǔn)文號、規(guī)格、包裝、批號、數(shù)量、處方來源或主要成份、制劑方法、檢驗依據(jù)、給藥途徑等。歷版《中國藥典》都是按照給藥途徑、制劑方法、藥物成份來制定制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，如2015版《中國藥典》[1]將“非無菌含藥材原粉的中藥制劑”標(biāo)準(zhǔn)中的固體口服給藥制劑細分為是否含有豆豉、神曲等發(fā)酵原粉的情況，藥品所含成份不同，標(biāo)準(zhǔn)亦有較大變化；中藥制劑如若沒有制劑方法，也就無法得知其是否含有藥材原粉，相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)也就大相徑庭；藥典明確規(guī)定“用于手術(shù)、嚴重?zé)齻?、嚴重?chuàng)傷的局部給藥制劑應(yīng)符合無菌檢查法規(guī)定”，用于表皮或黏膜是否完整的固體局部給藥制劑其在需氧菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)上相差1個數(shù)量級，可見給藥途徑信息的重要性。

2.3 試驗環(huán)境及設(shè)備

藥典對微生物計數(shù)試驗環(huán)境進行了明確規(guī)定，單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進行檢測[5]。新版藥典將潔凈度分為A、B、C、D四個級別，究其原因，一方面是全面與國際藥典標(biāo)準(zhǔn)相接軌，另一方面是從對終產(chǎn)品的檢驗向過程控制轉(zhuǎn)變，這方面的資料的缺失勢必會影響整個試驗數(shù)據(jù)的可信度。

112份資料中無儀器校驗記錄者比例較大，約占83.9%。對于微生物試驗來說，溫度、壓力、稱量、容量等都是影響試驗準(zhǔn)確性的關(guān)鍵參數(shù)，一臺沒有經(jīng)過校驗的培養(yǎng)箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器勢必會影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 培養(yǎng)基及菌種

現(xiàn)在實驗室大多使用的是商品化的成品脫水培養(yǎng)基，其質(zhì)量依賴于其制備過程，從而影響試驗結(jié)果的可靠性。所以所有配制好的培養(yǎng)基均應(yīng)進行質(zhì)量控制試驗，常規(guī)項目包括pH值及適用性檢查試驗。

藥典[1]明確規(guī)定，藥品微生物檢驗用的試驗菌均應(yīng)來自認可的國內(nèi)或國外菌種保藏機構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株，并且明確規(guī)定工作菌株的傳代次數(shù)不得超過5代，試驗資料中沒有菌株代數(shù)、來源等相關(guān)信息，就無法保證其正常的生物學(xué)特性，最終影響試驗數(shù)據(jù)的可靠性及整個資料的完整性。

2.5 計數(shù)方法適用性試驗及控制菌檢查方法適用性試驗

計數(shù)方法適用性試驗[6]及控制菌檢查方法適用性試驗是整個試驗過程的主體，至關(guān)重要。2015版《中國藥典》較老版藥典較大改動的地方是，規(guī)定供試液與菌液必須先混合若干時間后再進行計數(shù)，且明確了所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%，然而占6.3%的資料采用“在試管中加入10 ml供試液，再加入不大于100 cfu/ml的菌液1 ml”來進行試驗組的計數(shù)。

3 建議

綜上所述，一份完整的微生物限度檢查方法適用性試驗資料除以上所列主要內(nèi)容外，建議還應(yīng)包括下列內(nèi)容：適用性試驗方案的組織與實施部門及質(zhì)量管理部門有關(guān)人員的簽字，其過程包括方案起草、方案審核和方案批準(zhǔn)等步驟；驗證周期、有關(guān)制式文件以及偏差處理等[7]。

藥品微生物限度檢查同理化性質(zhì)檢查及有效成分的含量測定不同，其待檢對象所處的環(huán)境多樣，污染源復(fù)雜，污染狀態(tài)也會出現(xiàn)差異，面對菌細胞的活體易變性，同一生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的同一批藥品污染狀態(tài)會出現(xiàn)差異，即使同一種菌在不同的劑型中所測得的結(jié)果也各不相同。開展微生物限度檢查方法適用性試驗工作，更是一個極冗長繁瑣、耗時耗力的過程，除要建立一個符合標(biāo)準(zhǔn)要求、操作安全的實驗室外，從事微生物檢驗的工作人員必須經(jīng)過無菌技術(shù)及基礎(chǔ)微生物學(xué)專業(yè)知識的培訓(xùn)，同時建議有關(guān)部門制定相關(guān)管理制度，并定期進行抽查和考核，將考核結(jié)果利用網(wǎng)絡(luò)等大眾媒體進行公示，嚴格規(guī)范其相關(guān)準(zhǔn)入制度，促進我國藥品微生物限度檢查規(guī)范有序的發(fā)展[8]。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：145-149.

[2] 楊曉莉，李輝，馬英英，等.中國藥典2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法解讀[J].藥物分析雜志，2016，36（6）：1101-1107.

[3] 楊曉莉，李輝，馬英英，等.《中國藥典》2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:控制菌檢查法解讀與對策[J].中國藥師，2016，19（4）：748-752.

[4] 羅書香.藥品微生物限度檢查方法驗證資料分析[J].中國藥事，2007，21（7）：525-526.

[5] 張國林.藥品微生物檢驗實驗室質(zhì)量控制影響因素分析[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2017，14（19）：26-29.

[6] 田冬梅，史春輝，婁志紅，等.藥品微生物計數(shù)方法及方法適用性探討[J].中國藥物評價，2017，34（2）：97-99.

[7] 楊平，曾蔚欣，時正媛，等.醫(yī)院藥師微生物限度檢查培訓(xùn)的實踐與體會[J].中國藥師，2017，20（6）：1114-1116.

[8] 柳瑩，相坤.非無菌藥品的微生物限度檢查概述[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2018，18（2）：34-35.