蘇永華 李賽玉 陳麗靜 李彩香 鐘素成

近幾年來，臨床肺曲霉菌病發(fā)病率逐年攀升，死亡率高，但實(shí)驗(yàn)室檢查診斷準(zhǔn)確性較低，疾病診斷準(zhǔn)確性也更低[1]。肺曲霉菌病判定金標(biāo)準(zhǔn)為組織病理判定，但危重疾病者取得病變組織難度較大，雖給予影像學(xué)診斷，可得到部分典型性影像特征，但會延遲診斷時(shí)間，缺乏特異性。實(shí)驗(yàn)室高靈敏度曲霉菌PCR檢查，測定血液內(nèi)曲霉菌細(xì)胞壁成分半乳甘露聚糖的GM實(shí)驗(yàn)均在臨床得到快速應(yīng)用，但仍然無法代替培養(yǎng)病原維生物的痰液標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)化檢驗(yàn)，識別痰液檢查有形成分，培養(yǎng)污染得到控制，為及時(shí)、準(zhǔn)確的判定肺曲霉菌病提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)，降低疾病死亡率[2]。本研究納入280例痰液標(biāo)本，意在分析痰液檢驗(yàn)診斷肺曲霉菌病的臨床價(jià)值。具體報(bào)告如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料

隨機(jī)抽取280例實(shí)驗(yàn)室痰液培養(yǎng)標(biāo)本，包含男性152例，女性128例，年齡（63.2±1.2）歲，120例存在肺炎、COPD、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等肺部基礎(chǔ)性疾病，124例器官惡性腫瘤，36例其他疾病。分布在我院ICU住院病例、腫瘤科、小兒科、神經(jīng)外科、消化血液內(nèi)科、呼吸內(nèi)科等。

1.2 方法

1.2.1 檢驗(yàn)痰液的方法 檢驗(yàn)痰液包含孢子檢查、真菌菌絲檢查、細(xì)胞成分檢查、真菌培養(yǎng)等。

1.2.2 留取痰液標(biāo)本 采集標(biāo)本的方法包含吸痰器抽、纖維支氣管鏡輔助抽吸、自主咳痰。按照其病情狀況和意識狀況給予合理性留取方法。護(hù)理人員需仔細(xì)向患者講解留取標(biāo)本注意事項(xiàng)，咳痰前需用生理鹽水漱口3次，再咳嗽，并輔助性叩擊其背部，將肺部深處痰液咳嗽出，所咳出的第一口痰液需丟棄，第2～5口痰液留取10 g，吐入到無菌培養(yǎng)皿直徑9 cm中，1 h內(nèi)送檢。若延遲送檢，需將其放入到6℃左右環(huán)境中保存，2 h內(nèi)送檢。持續(xù)送檢3 d。針對痰液黏稠，且不易咳出者，可用蒸餾水進(jìn)行霧化后，再將其吸出，并給予輔助方式將痰液標(biāo)本抽取。

1.2.3 痰液培養(yǎng) 把所接收的標(biāo)本進(jìn)行沙氏培養(yǎng)基、中國藍(lán)培養(yǎng)基、羊血培養(yǎng)基。接種量為0.5～1 g。3 mm直徑接種環(huán)取5次，不同痰液黏稠度進(jìn)行加減。并放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h。并實(shí)施藥敏試驗(yàn)與真菌菌種鑒定。

1.2.4 痰液顯微鏡檢查 取5 g痰液，將其均勻涂抹在無菌載玻片上，涂抹范圍為2 cm×4 cm，厚薄合適則可。低倍鏡觀察第1片痰液成分，順著軌跡，從左到右瀏覽全片，并觀察上皮細(xì)胞與孢子、真菌菌絲體、顆粒狀物、螺旋體、白細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、鱗狀上皮細(xì)胞的關(guān)系。加入10% KOH溶液3滴到第2片上，加蓋玻片，用低倍鏡查找菌絲體與真菌孢子。瑞士染色處理第3片，準(zhǔn)確分類各細(xì)胞。

1.2.5 判定痰液標(biāo)本的合格性 按照痰液所含成分、形狀和顏色綜合判定痰液質(zhì)量，顯微鏡低倍視野：白細(xì)胞指標(biāo)＞25個(gè)、鱗狀上皮細(xì)胞＜10個(gè)或白細(xì)胞/上皮細(xì)胞＞2.5個(gè)；唾液樣需直接判定為不合格性標(biāo)本，需重新留取包含食物殘?jiān)臉?biāo)本。需檢驗(yàn)并符合以下任何一項(xiàng)指標(biāo)：（1）WBC指標(biāo)高，膿性各色痰液；（2）暗紅色、鮮紅血性痰液；（3）漿液性或黏液性，白細(xì)胞指標(biāo)＞25個(gè)、鱗狀上皮細(xì)胞＜10個(gè)或白細(xì)胞/上皮細(xì)胞＞2.5個(gè)；（4）顯微鏡下存在大量細(xì)或粗顆粒狀物，少見粒細(xì)胞成分。

1.3 指標(biāo)判定

培養(yǎng)可疑：持續(xù)3天送檢，各合格痰液內(nèi)任意一種，2次或2次以上痰培養(yǎng)均屬于同一菌株和三種培養(yǎng)基均可生長。生長陽性：持續(xù)三天送檢，排除第三類合格痰液中任意一種，查見真菌孢子次數(shù)為3次，痰培養(yǎng)≥2次為三種培養(yǎng)基和同一菌株均可生長：（1）查見螺旋體次數(shù)≥1次；（2）嗜酸性粒細(xì)胞≥50%；（3）柱狀上皮細(xì)胞≥2+/HP。協(xié)同陽性：持續(xù)3天送檢，4類合格痰液中任意一種≥2次痰培養(yǎng)：（1）查見菌絲次數(shù)≥1次；（2）嗜酸性粒細(xì)胞≥10%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究計(jì)量和計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS 13.0版本）分析，表示方式、（n，%），計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，若P＜0.05，則判定結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰液真菌培養(yǎng)種類分布

280例痰液標(biāo)本中，陽性占比最高為念珠菌63.93%，其次為煙曲霉菌26.79%。見表1。

2.2 顯微鏡下其他真菌與曲霉菌的區(qū)別

曲霉菌菌絲分支分隔為銳角，無色素，2～4 μm寬度，孢子形狀為圓形，且小。念珠菌菌絲為1～2μm寬，屬于假菌絲，孢子形狀為圓形，往往有出芽。毛霉菌菌絲體積較寬，分支為直角，2～8μm寬度。經(jīng)臨床診斷后共21例培養(yǎng)可疑，29例生長陽性，34例協(xié)同陽性。培養(yǎng)可疑、生長陽性、協(xié)同陽性三者兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。經(jīng)檢查后過敏性肺曲霉肺炎共6例，34例侵襲性肺曲霉菌病，45例肺曲菌球，給予痰液培養(yǎng)檢查，對比肺曲菌球陽性率（17.78%）與侵襲性肺曲霉菌?。?9.41%）、過敏性肺曲霉肺炎陽性率（83.33%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表3。

表1 痰液真菌培養(yǎng)種類分布[n（%）]

表2 各痰液培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)對判定肺曲霉菌病的有效率

表3 不同肺曲霉菌病痰液培養(yǎng)陽性率[n（%）]

3 討論

曲霉菌也稱弗狀菌，此為需住院接受治療的系統(tǒng)性真菌。多在腎移植患者中發(fā)病，患者死亡率可達(dá)70%以上[3]。引發(fā)疾病的曲霉菌類包含黑曲菌、上曲菌、黃曲菌、煙曲菌等。肺組織為感染曲霉菌的一個(gè)好發(fā)器官。人類95%的曲菌病菌因煙曲菌而引發(fā)的[4]。本次研究表明，曲霉菌為痰液真菌培養(yǎng)陽性率第二位。

感染肺曲霉菌機(jī)理不同，痰液檢出率不同：臨床將肺曲霉菌分三個(gè)類型：侵襲性肺曲霉菌病、過敏性支氣管肺曲霉菌病、慢性肺曲霉菌病。侵襲性肺曲霉菌多在各種器官移植、以及各種惡性腫瘤、HIV病毒感染、白血病等患者中發(fā)生。嚴(yán)重破壞肺組織，引發(fā)廣泛性化膿性肺炎，合并形成膿腫，容易引發(fā)凝固性急性壞死，快速擴(kuò)展，治療難度大，其死亡率高。因病變位置排出膿性分泌物，給予痰液培養(yǎng)檢出曲霉菌的可能性較大[5]，本研究中侵襲性肺曲霉菌病的培養(yǎng)陽性率達(dá)79.41%，與文獻(xiàn)相符[6]。而在判定過程中隨著判定標(biāo)準(zhǔn)的提升，特異性也有所增高，本研究中表2則明確體現(xiàn)了此點(diǎn)。慢性肺曲霉菌病包括：曲霉球、曲霉結(jié)節(jié)、慢性壞死性肺曲霉病、慢性空洞性肺曲霉菌病及慢性纖維化性肺曲霉菌病，其中肺曲霉球繼發(fā)在肺結(jié)核空洞、肺膿腫、支氣管擴(kuò)張、支氣管囊腫，繁殖于肺部空腔中，曲霉菌早期可因痰液排出人體外，形成晚期曲霉球，和支氣管幾乎不相通，給予痰液培養(yǎng)，檢出曲霉菌的可能性亦明顯降低。

建立痰液曲霉菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[7]：自然界中均廣泛存在曲霉菌，曲霉孢子體積小，數(shù)量多，且在空氣中的懸浮可能性較大，食物內(nèi)污染可能性較大。且給予真菌培養(yǎng)痰液標(biāo)本和顯微鏡檢查痰液標(biāo)本，具有隨意性，導(dǎo)致真菌培養(yǎng)痰液存在容易污染到標(biāo)本、標(biāo)本取樣不夠規(guī)范性的問題，進(jìn)而降低了曲霉菌陽性率。

解決以上問題的思路為留取痰液標(biāo)本，并保存、檢查、培養(yǎng)等過程，確保痰液標(biāo)本合格，以免被曲霉菌孢子污染，采用足夠量標(biāo)本。采集標(biāo)本前需漱口，并丟棄第一口痰液，降低痰液留取中污染性，痰液內(nèi)多種培養(yǎng)基培養(yǎng)、多次連續(xù)培養(yǎng)、菌絲體為鑒別偶爾污染的指標(biāo)。曲霉菌菌絲體僅在曲霉菌病灶位置繁殖可發(fā)生，散布在空氣內(nèi)孢子污染則不會發(fā)生菌絲體，給予顯微鏡觀察可見較大菌絲體[8]。曲霉菌多次培養(yǎng)可將污染因素成功篩選出。痰液細(xì)胞、性狀、顏色，以及有形成分均有利于判定痰液的病理意義，或是否合格。扁平磷狀上皮多在咽部、口腔部位分布，纖毛柱狀上皮則主要分布在各段支氣管和主支氣管部位。螺旋體多存在小支氣管部位，呈凝固蛋白絲。嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞雖不屬于肺部成分，但肺部過敏性病變痰液嗜酸性細(xì)胞會顯著增多，如合并曲霉菌，表明存在肺曲霉菌病變應(yīng)性支氣管炎。肺部曲霉菌和細(xì)菌感染往往合并產(chǎn)生，當(dāng)給予抗生素治療，可降低痰液膿細(xì)胞，痰液往往存在壞死顆粒物質(zhì)中。痰液定量顯微鏡涂片檢查與培養(yǎng)，可提升曲霉菌檢出可能性，避免發(fā)生漏檢，尤其是給予KOH飽和液涂片檢查，痰液內(nèi)細(xì)胞成分被破壞掉，提升微小孢子和曲霉菌絲體檢出率。

診斷肺曲霉菌疾病，按照是否合并基礎(chǔ)性疾病，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和影像學(xué)狀況實(shí)施分級、綜合診斷。但各檢查方式均具有一定限制性。將組織病理檢查和無菌位置曲霉菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)。但危重患者，不易得到活檢標(biāo)本，培養(yǎng)血液標(biāo)本的陽性率較低。綜上，痰液檢驗(yàn)在診斷肺曲霉菌病中作用明顯，可早期準(zhǔn)確判定肺曲霉菌病，以便及時(shí)給予有效診治，降低疾病死亡率，值得推廣。