張文通 魏 鳳李 峰王金良 苗立中沈志強(qiáng),

（1山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

隨著規(guī)?；B(yǎng)殖加速發(fā)展，豬病變得極為復(fù)雜，僅靠傳統(tǒng)診斷效果并不理想。目前從事豬病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)服務(wù)的單位主要有農(nóng)業(yè)高校或科研院所、飼料廠或獸藥廠、規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)及剛剛興起的“第三方”專業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)等[1-4]。這些服務(wù)機(jī)構(gòu)在檢測(cè)豬病病原時(shí)使用最多的方法是PCR方法。PCR方法因其特異、敏感、快速等優(yōu)點(diǎn)，獲得檢測(cè)人員的高度認(rèn)可。但在應(yīng)用PCR方法過(guò)程中，如果操作不規(guī)范，就會(huì)出現(xiàn)“假陽(yáng)性”或“假陰性”等錯(cuò)誤結(jié)果，從而誤導(dǎo)豬場(chǎng)防疫工作[5-8]。本文對(duì)應(yīng)用PCR方法檢測(cè)豬病臨床病料的一些注意事項(xiàng)進(jìn)行了概述，以期為檢測(cè)人員規(guī)范操作提供參考。

1 PCR方法介紹

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR（Polymerase Chain Reaction），是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得所需的大量特定基因片段。目前常用的豬病病原PCR檢測(cè)方法包括普通RCR或RT-PCR、多重PCR或RT-PCR、套式PCR或RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。

2 PCR方法在臨床應(yīng)用中的注意事項(xiàng)

2.1 對(duì)方法要求

使用PCR方法檢測(cè)某種豬病，需要依據(jù)相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有的是檢測(cè)人員或單位自建的，有的是來(lái)自參考文獻(xiàn)，比如文章、論文、專利或標(biāo)準(zhǔn)等。推薦應(yīng)用國(guó)家或行業(yè)認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。比如檢測(cè)偽狂犬病毒的PCR方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 18641-2002，豬圓環(huán)病毒的PCR方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 21674-2008，鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典株復(fù)合RT-PCR方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 27517-2011，豬鏈球菌2型PCR定型檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 19915.3-2005，等等。建議檢測(cè)人員按照國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)操作，檢測(cè)結(jié)果具有高度準(zhǔn)確性或認(rèn)可性。

2.2 對(duì)硬件設(shè)施要求

進(jìn)行PCR試驗(yàn)，需要分區(qū)操作，包括模板提取區(qū)、配液區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)和電泳區(qū)。要求人流及物流嚴(yán)格按照模板提取區(qū)—配液區(qū)—PCR擴(kuò)增區(qū)—電泳區(qū)路線單向流動(dòng)，嚴(yán)禁倒流。人流與物流通道分開，配液應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，電泳區(qū)應(yīng)有排風(fēng)及污染物處理設(shè)施。這4個(gè)區(qū)域應(yīng)配套專用的移液器、槍頭、工作服、手套及垃圾桶等耗材，嚴(yán)禁相互交叉使用。還需強(qiáng)調(diào)的是：如果做相關(guān)基因克隆、質(zhì)粒提取等工作，禁止在這4個(gè)區(qū)域操作。上述所有要求都是為了防止“氣溶膠污染”。為規(guī)范操作，檢測(cè)人員應(yīng)做好儀器使用、試劑領(lǐng)取和使用記錄。為避免頻繁反復(fù)凍融PCR試劑，如反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq酶、引物等，可將其分裝成小份使用。對(duì)于PCR所用的槍頭，要高壓處理，如果槍頭用于提取和反轉(zhuǎn)錄RNA、還需用DEPC水處理。有條件的實(shí)驗(yàn)室可做好儀器定期校準(zhǔn)驗(yàn)證工作。

2.3 對(duì)樣本要求

對(duì)樣本總的要求是新鮮、典型、適量及標(biāo)識(shí)清楚等。送檢人員需要根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床問(wèn)診及剖檢結(jié)果，對(duì)病死豬或病豬病因作出一些推斷；根據(jù)推斷病原，無(wú)菌采集典型病變組織，裝入自封袋并標(biāo)識(shí)清楚，放入裝有冰袋的泡沫箱以最快速度運(yùn)送至送檢單位。

對(duì)于豬瘟，主要采集扁桃體、淋巴結(jié)、全血、脾、腎；對(duì)于豬繁殖與呼吸綜合征，主要采集血液、肺、脾、扁桃體、淋巴結(jié)；對(duì)于豬流行性乙型腦炎，主要采集患病仔豬或死胎兒的腦組織、腦積液和血液；對(duì)于豬細(xì)小病毒病，主要采集死胎或腎、淋巴結(jié)、性腺；對(duì)于豬偽狂犬病，主要采集淋巴結(jié)、肺、扁桃體、腦；對(duì)于豬圓環(huán)病毒2型，主要采集肺、胰臟、腎、淋巴結(jié)；對(duì)于豬口蹄疫，主要采集水泡皮、水泡液、心臟；對(duì)于豬傳染性胃腸炎，主要采集腸、腸內(nèi)容物；對(duì)于豬流行性腹瀉，主要采集糞便、腸內(nèi)容物；對(duì)于豬輪狀病毒病，主要采集糞便、腸內(nèi)容物；對(duì)于豬巴氏桿菌?。ㄘi肺疫），主要采集肺（帶氣管）、淋巴結(jié)；對(duì)于豬大腸桿菌病，主要采集小腸及內(nèi)容物、肺臟、心臟；對(duì)于豬鏈球菌病，主要采集肝、脾、淋巴結(jié)、肺、血液；對(duì)于副豬嗜血桿菌感染，主要采集肺、腦、關(guān)節(jié)液、淋巴結(jié)；對(duì)于豬傳染性胸膜肺炎，主要采集肺、肝臟、全血、胸水；等等。

2.4 對(duì)操作要求

從事PCR檢測(cè)的操作人員一定要有質(zhì)量意識(shí)。每次PCR檢測(cè)除了樣本外，一定要設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照；嚴(yán)格、詳細(xì)做好實(shí)驗(yàn)記錄；注意在每個(gè)操作區(qū)更換工作服、鞋、口罩、手套等；在核酸提取和配液過(guò)程中，每添加1種試劑，更換槍頭；每天做完試驗(yàn)，及時(shí)清場(chǎng)，進(jìn)行消毒；注意個(gè)人防護(hù)，禁止在試驗(yàn)區(qū)域飲食，禁止不穿工作服進(jìn)入試驗(yàn)區(qū)域，試驗(yàn)過(guò)程中或結(jié)束后要用肥皂洗手等。

2.5 PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)后續(xù)分析要求

大多PCR檢測(cè)結(jié)果僅告訴送檢人員有無(wú)某個(gè)病原，并不能區(qū)分是野毒還是疫苗毒、強(qiáng)毒還是弱毒，不能區(qū)分病原的基因型。這就需要進(jìn)一步對(duì)送檢陽(yáng)性病料中病原基因組擴(kuò)增并測(cè)序，分析該病原是野毒還是疫苗毒、強(qiáng)毒還是弱毒以及基因型信息，從而推測(cè)病原來(lái)源以及與疫苗毒株的同源性等，更加精準(zhǔn)指導(dǎo)生產(chǎn)。

3 小結(jié)

PCR檢測(cè)在豬病診斷領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。但在實(shí)踐中往往會(huì)出現(xiàn)同一份病料送到不同檢測(cè)單位的檢測(cè)結(jié)果并不一致的現(xiàn)象。提示檢測(cè)單位的PCR操作水平高低不一，究其原因可能是有些檢測(cè)單位沒(méi)有獲得國(guó)家認(rèn)可的資質(zhì)，沒(méi)有嚴(yán)格的質(zhì)量管理體系。目前國(guó)家正在開展中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）認(rèn)證和中國(guó)計(jì)量認(rèn)證（CMA）工作，建議養(yǎng)豬場(chǎng)在送檢病料時(shí)，選擇有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。