魯 陳，李呂木，李 姍，衛(wèi)愛(ài)蓮，代張超，閆一博

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036）

犢牛腹瀉又稱犢牛拉稀，一年四季均可發(fā)生，是犢牛常發(fā)的一種胃腸疾病。根據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部2007年國(guó)家動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)系統(tǒng)——美國(guó)乳制品的報(bào)道，斷奶犢牛死亡率57%是由于腹瀉造成（Thomsen等，2012）。犢牛常在出生后2～3 d開(kāi)始發(fā)病，這對(duì)犢牛的發(fā)育、生長(zhǎng)、成活等有很大影響。在挪威每年產(chǎn)犢牛280000頭，但由于犢牛腹瀉死亡導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1000萬(wàn)美元（o/ster。a s等，2007）。目前在國(guó)內(nèi)外，臨床上多采用抗生素治療，常用的抗生素有β-內(nèi)酰胺類(lèi)青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)、氨基糖甙類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)和大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)等。在科索沃病牛的治療主要是應(yīng)用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和磺胺類(lèi)藥物，但抗生素使用規(guī)則和應(yīng)用得不到正確的監(jiān)測(cè)和記錄（I-braimi等，2015)?？股氐尼槍?duì)性不強(qiáng)，易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等問(wèn)題。補(bǔ)充益生菌即可以防治抗生素引起的腹瀉，也能改善乳糖不耐癥降低膽固醇水平，治療克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和腸易激綜合征（Reiff等，2010；Mcconnell等，2008）。 益生菌以其無(wú)毒副作用、無(wú)耐藥性、無(wú)殘留、成本低、效果顯著等被養(yǎng)殖界所認(rèn)同，飼喂乳酸菌能夠促進(jìn)母豬健康，并能保護(hù)斷奶仔豬的胃腸道菌群，減少致病菌的危害，促進(jìn)健康 （Kenny等，2011）。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌（主要包括嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌和L.乳酸菌）可以減少人腹瀉的發(fā)生率，乳糖不耐受性，降低血清膽固醇，刺激免疫系統(tǒng)，控制感染（Sharma等，2014）。乳酸菌能有效的對(duì)抗大腸桿菌和沙門(mén)氏菌，是腸道健康的微生物學(xué)指標(biāo)，健康的犢牛乳酸桿菌/大腸菌群比例比腹瀉犢牛高。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，母乳中的一些益生菌具有較好的抑菌能力，對(duì)幼兒的健康具有促進(jìn)作用（Jara等，2011）。因此，研究乳酸菌對(duì)養(yǎng)牛業(yè)具有重要的意義。

1 微生態(tài)制劑抗?fàn)倥８篂a

在正常飼養(yǎng)條件下，犢牛腸道內(nèi)微生物菌群的平衡容易受到破壞而產(chǎn)生腹瀉。剛出生的牛犢，腸道菌群不穩(wěn)定，容易受病原微生物感染引發(fā)腸道疾病，特別是腹瀉，會(huì)降低犢牛消化率，減少對(duì)養(yǎng)分的消化吸收 （Signorini等，2012；Lucas等，2007）。用益生菌飼喂?fàn)倥＃貏e是乳酸菌 （Corcionivoschi 等 ，2010；Morrison 等 ，2010；Riddell等，2008）能改善腸道健康，提高消化利用率，提高生產(chǎn)性能（Frizzo 等，2012；Frizzo 等，2011）。

2 乳酸菌的生理功能

2.1 乳酸菌對(duì)病原菌的抑制作用 益生菌的作用機(jī)制目前雖然存有爭(zhēng)議，但一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)排斥腸道中黏附的病原微生物而發(fā)揮作用（Corcionivoschi 等 ，2010；Morrison 等 ，2010；Riddell等，2008）。通過(guò)調(diào)控腸道菌群的平衡，降低pH，然后經(jīng)乳酸發(fā)酵、產(chǎn)生細(xì)菌素和刺激免疫系統(tǒng)、提高養(yǎng)分利用率，從而影響宿主健康（Salim等，2013）。

乳酸菌發(fā)酵可產(chǎn)生大量的酸性代謝產(chǎn)物，如揮發(fā)性脂肪酸和乳酸等,使腸道內(nèi)pH不斷下降，形成酸性環(huán)境，抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的增殖,從而達(dá)到對(duì)有害菌的抑制作用 （Isolauri等，2004）。其中乳酸主要是降低pH來(lái)增強(qiáng)其他酸的活性，乙酸有較強(qiáng)的抑菌范圍，能夠抑制真菌、細(xì)菌以及其他一些有害菌，丙酸對(duì)真菌有很強(qiáng)的抑制作用，乳酸和乙酸的混合物比其單一酸能更好地降低鼠沙門(mén)氏菌的活率（孟祥晨等，2009）。

胞外多糖能夠發(fā)揮抑菌作用，乳酸菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)復(fù)雜的胞外多糖，構(gòu)成乳酸菌特有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)（Buchovec等，2010）。目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌有嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種等。雙歧桿菌和植物乳桿菌產(chǎn)生的胞外多糖在300 μg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌、阪崎腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌和志賀氏菌具有抗菌活性（Li等，2014）。胞外多糖對(duì)于益生菌與致病菌的競(jìng)爭(zhēng)性黏附也可起到調(diào)控作用，同時(shí)也能減弱真核細(xì)胞細(xì)菌毒素 （Luksiene等，2011；Luksiene等，2010）。通過(guò)黏附和定植在小腸的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)病原菌產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用（Collado等，2007；Lund 等，2002）。

嗜酸乳桿菌是一個(gè)非常重要的益生菌（Sanders等，2001）。其通過(guò)黏附和定植腸道黏膜而對(duì)健康產(chǎn)生重要作用（Buck等，2005），具有顯著的抗腫瘤活性，降低膽固醇，抑制有害菌，調(diào)節(jié)菌群，維持腸道微生態(tài)平衡和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力（Medellinpena等，2009）。嗜酸乳桿菌可以產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，具有非特異性抗菌和止瀉作用。此外，嗜酸乳桿菌還能顯著增加細(xì)胞因子、趨化因子和炎癥介質(zhì);能作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品和飼料加工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域；并且作為免疫疫苗的載體而具有潛在的應(yīng)用價(jià)值 （Peterson等，2007；Seegers等，2003）。

2.2 乳酸菌對(duì)胃腸道菌群平衡以及糞便菌群的影響 益生菌是活的微生物，試驗(yàn)證明補(bǔ)充天然的胃腸道菌可以促進(jìn)機(jī)體的健康 （Bosch等，2012）。年幼動(dòng)物腸道微生物的平衡是影響健康狀況的重要因素之一，尤其是對(duì)于犢牛，在免疫系統(tǒng)未發(fā)育成熟之前很容易引發(fā)腹瀉和呼吸道疾?。═akeshi等，2009）。越來(lái)越多的研究報(bào)道表明，飼喂動(dòng)物過(guò)程中增加益生菌的數(shù)量，能夠降低病原微生物的危害，從而保護(hù)動(dòng)物腸道的健康，降低腸道疾病和呼吸道疾病的發(fā)生率 （Gaggia等，2010；Corcinivoschi等，2010；Lallès等，2007）。 在集約化的養(yǎng)牛場(chǎng)，剛出生的犢?？赡苡捎谖改c道中原有的微生物量較少和生長(zhǎng)較弱，腸道微生物的菌群平衡很容易遭到破壞（Frizzo等，2010）。腹瀉會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)大腸菌群數(shù)的增加，降低乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)（Krehbiel等，2003）。在腸道中大腸菌群的增加可能會(huì)產(chǎn)生腐敗物質(zhì)來(lái)傷害機(jī)體（Fujisawa等，2010）。因此，腸道菌群對(duì)宿主的健康和發(fā)育具有非常重要的作用（Ng等，2009）。而哺乳期犢牛飼喂益生菌可以改善腸道健康和促進(jìn)消化，降低腹瀉和呼吸問(wèn)題對(duì)犢牛造成的影響（Timmerman等，2005）。

抗生素已被證明能夠干擾腸道菌群平衡，通過(guò)殺死敏感的腸道菌群來(lái)治療疾病，在抗生素治療后，補(bǔ)充益生菌能夠有效恢復(fù)胃腸道菌群的平衡。多年來(lái)，益生菌已被作為一種有效的抗生素替代品來(lái)飼喂動(dòng)物，通過(guò)影響腸道菌群來(lái)對(duì)宿主動(dòng)物產(chǎn)生有利影響 （Kenny等，2011；Gaggia等，2010）。許多研究表明，益生菌對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、腹瀉和腸道菌群都有有利影響（Kawakami等，2012；Aldana 等，2009）。 常用的益生菌有嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌，試驗(yàn)證明這些益生菌能增加抗生素治療后腸道有益菌群的菌落（Madden等，2005）。乳酸桿菌對(duì)腸道中的厭氧菌群有扶植作用，對(duì)需氧菌群的生長(zhǎng)則起限制作用，有助于調(diào)整腸道正常菌群之間的相互關(guān)系，維持胃腸道微生態(tài)環(huán)境平衡。對(duì)斷奶前犢牛飼喂含益生元（含有乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物）日糧發(fā)現(xiàn)糞便中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量增加，犢牛腹瀉降低（Quezada-Mendoza等，2011）。在犢牛腹瀉期進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，周期性飼喂乳酸菌和乳糖，可以建立一個(gè)更加穩(wěn)定和平衡的胃腸道菌群，降低腹瀉發(fā)病率（Frizzo 等，2011）。

研究用復(fù)合益生菌（乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌等）發(fā)酵無(wú)抗飼料，菌液、水和無(wú)抗全價(jià)飼料按質(zhì)量的5%、33%和60%進(jìn)行混合發(fā)酵，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)育肥豬日糧中添加20%的無(wú)抗飼料，能顯著提高末重、平均日增重和平均日采食量（P<0.05）,顯著增加腸道中乳酸菌的數(shù)量，降低大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的數(shù)量（P<0.05），提高生長(zhǎng)育肥豬的生長(zhǎng)性能，改善腸道微生物平衡，增強(qiáng)消化能力（周映華等，2015）。斷奶后仔豬直接飼喂0.1%羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌復(fù)合體能提高氮和總能消化率，增加糞便中乳酸菌的濃度，降低腹瀉評(píng)分、糞便中的有害氣體排放與仔豬大腸桿菌濃度（Zhao等，2015）。封裝的益生菌（乳酸菌）和龍眼汁一起口服，能夠增加人腸道中的雙歧桿菌數(shù)和減少糞大腸菌和梭狀芽孢桿菌數(shù)（Chaikham等，2012）。對(duì)大鼠飼喂乳酸菌和雙歧桿菌，可促進(jìn)甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和總膽汁酸（TBA）的代謝，降低糞腸桿菌科、腸球菌和大腸桿菌數(shù)（Zhi等，2015）。

3 在生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 乳酸菌在防治犢牛腹瀉中的應(yīng)用 在犢牛腹瀉導(dǎo)致的高死亡率的農(nóng)場(chǎng)飼喂109cfu/kg的益生菌35 d，能顯著體現(xiàn)出益生菌的優(yōu)勢(shì)，提高小牛的生長(zhǎng)、改善小牛的健康和提高存活率（Frizzo等，2008）。犢牛出生后馬上投喂糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌，可使其腹瀉發(fā)病率由82%降至35%，病死率由10.2% 降至2.8%（Kim等，2007）。給新生犢?？诜匍L(zhǎng)形雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，均可提高增重和飼料轉(zhuǎn)化率，如果將兩者同時(shí)飼喂，可以減少腹瀉的發(fā)生。對(duì)比抗生素治療，飼喂益生菌具有明顯的優(yōu)勢(shì)，益生菌具有不損壞有益菌，增強(qiáng)腸道內(nèi)菌群平衡能力，無(wú)耐藥菌的產(chǎn)生等優(yōu)勢(shì)。研究表明直接飼喂益生菌 （包括乳酸菌、芽孢桿菌酵母、釀酒酵母菌和非致病性大腸桿菌）（Nissle 1917）混合產(chǎn)品代替抗生素預(yù)防犢牛腹瀉，能更好的降低腹瀉發(fā)病率，對(duì)群體間的生長(zhǎng)性能不產(chǎn)生明顯的差異，顯示出益生菌能很好的代替抗生素進(jìn)行使用（Kim 等，2011）。

對(duì)168頭新生健康犢牛每天飼喂30 g乳酸菌制劑 （干酪乳桿菌HM-09、植物乳桿菌HM-10）15 d發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組發(fā)生腹瀉的犢牛，用乳酸菌制劑進(jìn)行治療，100 g/（次·頭），2 次/d，腹瀉犢牛無(wú)死亡現(xiàn)象，但對(duì)照組死亡率為3.57%；其中27頭腹瀉犢牛飼喂乳酸菌制劑治療5 d后腹瀉率由100%下降為3.70%，腹瀉治愈率達(dá)到85.19%，表明雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌能刺激反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育并促進(jìn)瘤胃微生物的生長(zhǎng)和活性，維持瘤胃液pH正?；ㄒ?guó)強(qiáng)等，2014）。對(duì)432頭初生犢牛灌服復(fù)合活菌制劑，試驗(yàn)3個(gè)月發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組犢牛飼喂微生態(tài)制劑腹瀉率為4.8%，成活率為96.4%，試驗(yàn)組腹瀉率比對(duì)照組低6%，成活率提高8.1%。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在初生犢牛腸道菌群未形成之前飼喂益生菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，可以促進(jìn)犢牛腸道正常菌群形成，發(fā)揮生物屏障的作用，有效預(yù)防腹瀉的發(fā)生（李春生等，2010）。聯(lián)合飼喂植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌能夠降低犢牛的腹瀉持續(xù)時(shí)間，增加糞便中乳酸菌和腸桿菌數(shù)量，試驗(yàn)結(jié)果表明枯草芽孢桿菌可用于調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡和預(yù)防小牛腹瀉（Lee等，2012）。

對(duì)12頭犢牛進(jìn)行5個(gè)月的飼喂試驗(yàn)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸菌（包括嗜酸乳桿菌CBT，乳酸菌素和假鏈狀雙歧桿菌204）能顯著增加犢牛體重，調(diào)節(jié)胃腸道菌群的平衡，對(duì)糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)糞便中的致病菌數(shù)降低，體外共培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)能夠抑制病原菌的生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明乳酸菌能改善犢牛健康降低腹瀉（An等，2011）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼喂含乳酸菌和酵母菌的代乳粉能顯著增加日增重、飼料轉(zhuǎn)化和減少糞便評(píng)分，促進(jìn)生長(zhǎng)和抑制黑白花奶牛的腹瀉（Kawakami等，2012）。

3.2 乳酸菌在抗牛病毒性腹瀉/黏膜病中的應(yīng)用 牛病毒性腹瀉/黏膜?。˙VD/MD）是一種世界性分布的牛傳染病，對(duì)牛肉和奶制品行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)影響（Cowley等，2012）。其是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的（Wei等，2014）。EO基因是一個(gè)重要的保護(hù)性抗原基因型，其產(chǎn)生的包膜糖蛋白能誘發(fā)抗體發(fā)生中和反應(yīng)。BVDV主要抗原決定簇是包膜蛋白EO，可誘導(dǎo)發(fā)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。其基因序列高度穩(wěn)定，這使得其可以成為BVDV的合適抗原來(lái)產(chǎn)生基因工程疫苗和進(jìn)行免疫診斷（Zimmerman等2006；Seegers等，2003）。嗜酸乳桿菌作為一種佐劑具有雙重作用，能顯著增強(qiáng)外源性抗原的免疫原性和作為重組疫苗的細(xì)菌載體 （Peterson等，2007；Zimmerman等，2006）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)把E0基因連接到pMG36e載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pmg36e-e0，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)化改變嗜酸乳桿菌LA-5，SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）結(jié)果表明目的基因通過(guò)pMG36e載體在嗜酸乳桿菌LA-5中能夠高效表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡分析發(fā)現(xiàn)，利用多克隆抗體對(duì) BVDV和HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物可對(duì)BVDV產(chǎn)生抗體反應(yīng)，表明E0基因可作為候選基因在活載體產(chǎn)生疫苗來(lái)發(fā)揮免疫作用（Zhao等，2015）。

重組嗜酸乳桿菌能促進(jìn)腸黏膜下細(xì)胞增殖，巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力（Zhang等，2008）。其可以激活單核細(xì)胞并促進(jìn)單核細(xì)胞增殖，刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖、活性和細(xì)胞毒性，產(chǎn)生大量的IL-12和IFN-γ（抗菌免疫的重要細(xì)胞因子）（Shida 等，2011）。腸上皮是腸黏膜屏障的重要組成部分，可參與黏膜免疫。正常菌群定植在腸道黏膜表面，并調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的生理功能。研究表明，補(bǔ)充益生菌可以恢復(fù)和維持腸道正常菌群的生理功能，促進(jìn)菌群吸附和調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞，抑制腸內(nèi)異常的免疫反應(yīng)，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)（Dimitonova等，2007）。重組嗜酸乳桿菌可誘導(dǎo)腸黏膜免疫反應(yīng)，促進(jìn)腸黏膜分泌SIgA，增強(qiáng)腸黏膜免疫功能（Perdigón等，2001）。

血清IgG是體液免疫的初級(jí)抗體，在動(dòng)物抗感染免疫中起重要作用。E0蛋白是牛病毒性腹瀉病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可誘導(dǎo)免疫球蛋白發(fā)生抗體反應(yīng)，在誘導(dǎo)抗牛病毒性腹瀉病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Seegers等，2003）。含 BVDV的小鼠接種pmg36e-e0-la-5疫苗，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種疫苗的小鼠，成活率達(dá)90%。說(shuō)明pmg36e-e0-la-5疫苗能有效提高小鼠的免疫反應(yīng)，降低BVDV對(duì)小鼠的致病性，為后續(xù)重組乳酸菌在牛體內(nèi)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)（Zhao等，2008）。

4 小結(jié)

目前乳酸菌應(yīng)用研究最廣泛，但其他益生菌在犢牛腹瀉的應(yīng)用中也越來(lái)越受到重視。因此，在未來(lái)養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)上研究開(kāi)發(fā)新品種益生菌制劑是很有必要的，同時(shí)開(kāi)發(fā)益生菌混合菌劑也具有很好的發(fā)展前途，另外，需要對(duì)益生菌抗?fàn)倥８篂a的機(jī)理和代謝途徑進(jìn)一步進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)益生菌的飼喂方式和方法也要進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)，以保證能最大程度的發(fā)揮益生菌的優(yōu)勢(shì)作用。

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