任璐，劉思雨，鐘燕，索化夷*

(1.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶第二師范學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067)

參與豆豉發(fā)酵的微生物與豆豉品質(zhì)、風(fēng)味及酶活等密切相關(guān)。豆豉制曲階段的優(yōu)勢(shì)霉菌是總狀毛霉[5]，豆豉中纖維素酶、蛋白酶等酶活性決定了粗纖維、蛋白質(zhì)等降解速度，影響豆豉的色澤變化、質(zhì)構(gòu)變化[6]。毛霉型豆豉采用自然發(fā)酵工藝，發(fā)酵周期長(zhǎng)，沒(méi)有一種優(yōu)良而穩(wěn)定的發(fā)酵劑。張雨浩等[7]發(fā)現(xiàn)酶通過(guò)催化蛋白質(zhì)降解，為黑色素形成提供底物。孫森等[8]分析了天然發(fā)酵豆豉中的微生物菌相及關(guān)鍵酶酶活變化。目前對(duì)毛霉型豆豉微生物區(qū)系、黑色素形成機(jī)理等方面的深入研究較多，但對(duì)毛霉菌株發(fā)酵能力的評(píng)價(jià)較少。

本文從永川豆豉和三臺(tái)豆豉中分離得到2株總狀毛霉，對(duì)其蛋白酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力進(jìn)行分析，對(duì)傳統(tǒng)毛霉型菌株間的差異做一簡(jiǎn)要闡述，為毛霉型豆豉安全高效發(fā)酵劑的研發(fā)，實(shí)現(xiàn)豆豉的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

該實(shí)驗(yàn)材料采自永川豆豉食品有限公司和四川省三臺(tái)縣三臺(tái)農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

美國(guó)OMEGA公司生產(chǎn)的真菌DNA提取試劑盒(Fungal DNA Min Kit)、dNTP Mixture(10 mmol/L)、Taq Plus(5 U/μL)、10×Taq Plus Buffer(含Mg2+)、6×DNA Loading Buffer、λDNA/HindⅢMarker、LD2000 plus DNA Ladder、Gold View Ⅰ型核酸染料、50×TAE；

福林試劑(Folin試劑)、3，5-二硝基水楊酸(DNS)、三氯乙酸、干酪素、水楊素等均為分析純(AR)；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)[9]、麩皮培養(yǎng)基。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Mini-PROTEAN Tetro Cell核酸電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-RAD公司；G:Box EF 凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司；EDC-810 雙槽PCR儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；光學(xué)顯微鏡。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 毛霉的分離純化

取永川豆豉樣品25 g至錐形瓶中，加225 mL滅菌純水，于攪拌器上攪拌均勻。取1 mL上清液于EP管中，即為10-1稀釋度的樣液，依次按10倍稀釋6次，分別得到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀釋度的樣液。取0.1 mL不同稀釋度的樣液，涂布PDA平板，每種稀釋度做3個(gè)平行平板，倒置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次。3～5天后根據(jù)菌落形態(tài)和孢子顏色分離平板上生長(zhǎng)的所有菌種，在PDA平板中劃線接種于28 ℃培養(yǎng)，3～5天后重復(fù)分離步驟，直至分離出所有純化菌種，并在光學(xué)顯微鏡下觀察找到毛霉菌落。三臺(tái)豆豉做相同處理。

1.4.2 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

1.4.2.1 DNA的提取

參考Chen等[10]的方法，用真菌DNA試劑盒(Fungal DNA Min Kit)提取毛霉DNA。

1.4.2.2 PCR擴(kuò)增

取5 μL引物NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')、5 μL引物Fung(5'-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3')、5 μL dNTP Mixture(10 mmol/L)、5 μL Taq Plus(5 U/μL)、25 μL 10×Taq Plus Buffer(含Mg2+)和195 μL滅菌超純水混勻。取24 μL混合液與1 μL提取的DNA樣品配成PCR體系，另取24 μL混合液加入1 μL滅菌超純水作空白，放入PCR儀中進(jìn)行相應(yīng)的PCR，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4.2.3 DNA的電泳

選用0.8%的瓊脂糖凝膠，5 μL λDNA/HindⅢMarker加入樣品池的一端，1 μL 6×DNA Loading Buffer與5 μL DNA樣品混勻后依次加入樣品池。在80 V恒定電壓下電泳50 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并分析。

用1.4%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，5 μL D2000plus DNA Ladder加入樣品池的一端，其他條件同上。

1.4.2.4 測(cè)序與鑒定

PCR產(chǎn)物測(cè)序由華大基因完成，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI中的BLAST程序?qū)ふ遗c其有最大同源性的序列，最終確定2株菌的種屬關(guān)系。

1.4.3 測(cè)定酶活

1.4.3.1 制備待測(cè)酶液

純化的毛霉接種到麩皮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48天后加pH為7.2的磷酸緩沖液10 mL，破碎后在40 ℃抽提1 h，離心(3500 r/min)，離心液備用。

1.4.3.2 蛋白酶活測(cè)定

參照GB/T 23527-2009的方法測(cè)定[11]。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以不同濃度的酪氨酸與福林試劑反應(yīng)測(cè)出的OD660值為橫坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為縱坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取待測(cè)離心液1 mL于40 ℃水浴預(yù)熱2 min，加1 mL同樣預(yù)熱的酪蛋白，精確保溫10 min后加0.4 mol三氯乙酸2 mL，保溫20 min使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心。另取試管加濾液1 mL，0.4 mol碳酸鈉5 mL和福林試劑1 mL，搖勻后40 ℃保溫發(fā)色20 min并進(jìn)行光密度(OD)測(cè)定。每個(gè)樣品做3個(gè)平行和空白對(duì)照。空白實(shí)驗(yàn)在加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2 mL使酶失活，其他測(cè)定方法相同。

結(jié)果處理得到樣品蛋白酶活力單位如下：

式中：A為由樣品測(cè)得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K)；4為4 mL反應(yīng)液取出1 mL測(cè)定；N為酶液稀釋的倍數(shù)；10為反應(yīng)10 min；W為樣品水分百分含量。

1.4.3.3 纖維素總體酶活測(cè)定(FPA活力單位測(cè)定)

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和DNS顯色劑各2 mL，沸水浴10 min后定容至15 mL，測(cè)OD550值。以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，葡萄糖的mg數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試管內(nèi)加0.2 mL待測(cè)酶液和pH為4.8醋酸緩沖液1.8 mL，預(yù)熱至50 ℃后加1×6 cm濾紙條，在50 ℃恒溫水浴60 min，加DNS顯色劑2 mL并沸水浴加熱10 min，冷卻后加水至15 mL，測(cè)OD550值。

1.4.3.4 β-葡萄糖苷酶活測(cè)定(Cb酶活力單位測(cè)定)

參照Cheng[12]的方法，改進(jìn)后進(jìn)行毛霉β-葡萄糖苷酶活測(cè)定。

試管內(nèi)加0.2 mL待測(cè)酶液和1.8 mL水楊素(1%)，置50 ℃恒溫水浴60 min后加DNS顯色劑2 mL，沸水浴加熱10 min，冷卻后加水至15 mL，測(cè)OD550值。

結(jié)果處理，得到纖維素酶活力活力單位如下：

式中：x為樣品OD值的平均值；b和a由葡萄糖濃度和相應(yīng)的OD值通過(guò)回歸方程求得；n為酶液稀釋的倍數(shù)；T為酶促反應(yīng)的時(shí)間；0.2為所加酶液的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳圖像分析

提取不同毛霉的總DNA時(shí)，YC-1在Marker 23130 bp附近出現(xiàn)條帶，條帶完整，樣本提取成功，得到目的片段。

圖1 提取不同毛霉的DNA片段的圖像Fig.1 The image of DNA's fragment extraction from different mucor

注：M為Marker，1為空白，2和3為YC-1，4和5為ST-1。

由圖1可知，提取不同毛霉的DNA片段時(shí)，在Marker附近出現(xiàn)2，4，5號(hào)3條條帶，條帶清晰明亮，陰性對(duì)照無(wú)條帶，2個(gè)樣本擴(kuò)增成功。

2.2 菌株鑒定

表1 兩株菌種的鑒定Table 1 Identification of two kinds of strains

由表1可知，菌株YC-1和ST-1鑒定成功，片段長(zhǎng)度分別為677和679，同源性都為99%，鑒定出2株菌種皆為總狀毛霉。

2.3 酶活比較

圖2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of tyrosine

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白酶活。在40 ℃下每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of glucose

由圖3可知，樣品的纖維素總體酶活和β-葡萄糖苷酶活。1 mL酶液在50 ℃，pH為4.8條件下，每1 min水解1×6 cm的濾紙產(chǎn)生1 μg還原糖(以葡萄糖計(jì))的酶量定義為1個(gè)纖維素總體酶活力單位。1 mL酶液于50 ℃，pH為4.8條件下，每1 min水解1%水楊素溶液產(chǎn)生1 μg還原糖(以葡萄糖計(jì))的酶量定義為1個(gè)β-葡萄糖苷酶活力單位。

表2 兩種毛霉的酶活比較Table 2 Comparison of enzyme activities of two kinds of mucor U/mL

蛋白酶活性是評(píng)價(jià)豆豉發(fā)酵過(guò)程的重要指標(biāo)，蛋白酶將大分子蛋白水解成小分子多肽和氨基酸以及各種香氣成分。蛋白酶活性高低反映了豆豉中蛋白質(zhì)水解的速度，決定了豆豉發(fā)酵成熟的周期[13]。在以蛋白質(zhì)為主要成分的大豆制品中，蛋白酶活力的高低對(duì)豆豉發(fā)酵過(guò)程及蛋白質(zhì)降解有重要影響。如果豉曲的質(zhì)量不高，分泌的蛋白酶不足，影響成品成熟時(shí)間和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[14]。

由表2可知，YC-1和ST-1的蛋白酶活分別為176.891 U/mL和51.201 U/mL，且YC-1的蛋白酶活性明顯高于ST-1。與索化夷等研究發(fā)現(xiàn)永川豆豉制曲過(guò)程中酸性蛋白酶的最高酶活性291 U/g相比較低，發(fā)酵后階段永川豆豉蛋白酶活力降低到50～175 U/g。在自然發(fā)酵條件下，曲霉型自然發(fā)酵豆豉過(guò)程中的蛋白酶活性最高為190.24 U/g[15，16]，與YC-1相比差異不大，與ST-1的差異很大。在曲霉型和毛霉型豆豉研究中也表明可以通過(guò)降低食鹽含量，提高蛋白酶活性的方法縮短發(fā)酵周期。選育高活性蛋白酶產(chǎn)生菌是縮短發(fā)酵周期和提高風(fēng)味最簡(jiǎn)單和行之有效的方法[17]。

豆豉發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活性高低決定了大豆纖維素的降解程度，大豆纖維素的降解會(huì)降低豆豉的硬度、彈性和咀嚼度等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)。由表2的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YC-1和ST-1的纖維素總體酶活分別為107.645 U/mL和66.762 U/mL，YC-1的酶活顯著高于ST-1的酶活。索化夷等[18]發(fā)現(xiàn)在毛霉型制曲階段，豆豉纖維素酶活由發(fā)酵初期的0.54 U/g上升到制曲結(jié)束時(shí)的1.37 U/g，進(jìn)入后發(fā)酵階段纖維素酶的活性開始下降，在豆豉成熟時(shí)僅為0.03 U/g。以上表明YC-1和ST-1的纖維素總體酶活較高，其中YC-1的酶活高于ST-1的酶活。

微生物分泌β-葡萄糖苷酶作用于異黃酮糖苷，將大豆中糖苷型異黃酮向苷元型異黃酮轉(zhuǎn)化，而苷元型異黃酮更具有功能活性。因而，對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的研究有助于提高發(fā)酵豆制品的功能物質(zhì)。由表2可知，YC-1和ST-1的β-葡萄糖苷酶活分別為80.430 U/mL和95.362 U/mL，且ST-1的酶活稍高于YC-1的酶活。β-葡萄糖苷酶作用于異黃酮，增強(qiáng)了發(fā)酵豆制品的功能性，為功能性豆豉的生產(chǎn)提供了參考。

3 結(jié)論

毛霉是毛霉型豆豉發(fā)酵的主要菌株，其優(yōu)勢(shì)霉菌是總狀毛霉。從永川豆豉和三臺(tái)豆豉中分離到2株毛霉YC-1和ST-1，經(jīng)分離、純化、測(cè)序，鑒定為總狀毛霉。

2株總狀毛霉3種酶的酶活不同，YC-1和ST-1產(chǎn)蛋白酶活分別為176.891 U/mL和51.201 U/mL；產(chǎn)纖維素總體酶活分別為107.645 U/mL和66.762 U/mL；產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活分別為80.430 U/mL和95.362 U/mL?？傮w來(lái)說(shuō)，YC-1酶活力情況高于ST-1的酶活力。

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