高 玲，許冠生，張 磊，曾慶骨

（安徽迎駕貢酒股份有限公司，安徽霍山237200）

中國白酒由于其獨特的發(fā)酵工藝和產(chǎn)品風(fēng)格，在世界六大蒸餾酒中占有重要的地位。根據(jù)香氣特征，中國白酒通常分為濃香型、醬香型、清香型、米香型和其他香型。傳統(tǒng)濃香型白酒采用混蒸混燒工藝，即將原料的蒸煮和酒的蒸餾在甑桶內(nèi)同步進(jìn)行[1]。這種獨特的工藝使?jié)庀阈桶拙凭哂薪严銤庥?、綿柔甘洌、香味協(xié)調(diào)、尾凈幽長的風(fēng)格特點。因而，濃香型白酒深受消費者喜愛，其產(chǎn)量最高，在我國白酒市場中也占有重要的地位。在濃香型白酒的發(fā)酵過程中，窖池中各種微生物生化代謝及其相互作用、互相影響、協(xié)調(diào)發(fā)展共同構(gòu)成了窖池特定的微生態(tài)系統(tǒng)[2]。

窖池是由窖泥構(gòu)筑而成的地下泥坑，為釀造微生物提供合適的棲息場所。窖池中的發(fā)酵糟醅充當(dāng)著物質(zhì)循環(huán)、能量流動和信息傳遞的載體。窖池在連續(xù)投入生產(chǎn)的過程中，每一個輪次都是窖池微生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)發(fā)展和平衡過程，期間任何一個因素的異常變化都必將引起連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致窖池中代謝產(chǎn)物的成分和比例發(fā)生不同程度的變化，從而影響濃香型白酒的品質(zhì)和風(fēng)格[3]。因此，跟蹤窖池環(huán)境生態(tài)因子的動態(tài)變化對于了解窖池發(fā)酵情況是很有必要的。

鑒于此，本研究以不同層次發(fā)酵糟醅為對象，系統(tǒng)研究了發(fā)酵過程中窖池環(huán)境生態(tài)因子隨發(fā)酵時間的動態(tài)變化過程，為探索固態(tài)白酒釀造機理及生產(chǎn)工藝管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 窖池

本實驗采用工業(yè)規(guī)模的傳統(tǒng)發(fā)酵窖池，見圖1。該窖池建于2005年。窖池頂部長度和寬度分別為3600 mm和2300 mm，底部長度和寬度分別為2800 mm和1540 mm，窖池高為2400 mm。糟醅發(fā)酵是將待發(fā)酵糟醅轉(zhuǎn)移至窖池，窖皮泥封窖后，在自然條件下發(fā)酵70 d或更長時間。在本研究中，根據(jù)其在窖池中的位置，糟醅分為3個部分：上層、中層和下層(圖1)。發(fā)酵過程中，來自于窖泥、糟醅、大曲和周圍釀造環(huán)境中的微生物起著關(guān)鍵作用，濃香型白酒的特殊風(fēng)味在很大程度上依賴于這些微生物的演替[4]。

1.2 樣品來源

圖1 濃香型白酒窖池(A)和入滿糟醅窖池(B)示意圖

糟醅入窖池時間為2013年1月，發(fā)酵時間為11周，按入窖時間每間隔1周跟蹤取樣。發(fā)酵糟醅按上、中、下分層，同層又分中心部和周邊部，同一層3點取樣并混勻作為1個樣品。所有收集到的樣品都轉(zhuǎn)移到無菌袋，密封，并存儲在-20℃冰箱中，待分析。

1.3 酵母菌計數(shù)

采用稀釋平板菌落分離計數(shù)法對酵母菌進(jìn)行計數(shù)。所用培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30℃。

1.4 分析方法

水分測定采用105℃干燥箱烘干恒重法。酸度測定采用酸堿滴定法。淀粉和還原糖的測定采用斐林試劑法。酒精含量測定是首先取100 g糟醅加水200 mL，全玻璃蒸餾器蒸餾出100 mL溶液，然后采用比重法測定酒精度。糟醅中己酸、丁酸、乙酸、己酸、己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯的檢測，利用氣相色譜儀測其含量[5]。糟醅中乳酸采用液相色譜儀測定[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中溫度的變化

研究表明，糟醅發(fā)酵過程中的溫度變化主要取決于微生物的生長和代謝活性[7]。因此，發(fā)酵溫度的測定有助于了解微生物的代謝活動，從而對糟醅的發(fā)酵狀況進(jìn)行初步判斷。發(fā)酵過程中，將一個電子溫度探頭固定在發(fā)酵糟醅中心位置上，用數(shù)字溫度計測量每日溫度，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，窖池上層、中層、下層發(fā)酵糟醅整體的溫度變化基本符合“前緩、中挺、后緩落”的變化規(guī)律。

圖2 不同層次糟醅中溫度隨發(fā)酵時間的變化趨勢

窖池密封后，雖然與空氣隔離，一些好氧微生物如霉菌和酵母菌還可以利用糟醅顆粒間存在的稀薄空氣進(jìn)行有氧代謝并產(chǎn)生一定的熱量，從而導(dǎo)致窖池溫度的升高。當(dāng)糟醅中氧氣被耗盡后，乙醇發(fā)酵開始，窖池的溫度將繼續(xù)上升直至最高，并可以保持一段時間[8]。本研究中，在發(fā)酵初期，窖池上層、中層、下層的溫度逐漸升高，并分別在16 d、15 d和13 d時達(dá)到最大值。之后，由于缺少氧氣，以及乙醇和其他代謝產(chǎn)物的積累，霉菌和酵母菌的代謝活性逐漸降低[9]。生成的熱量也逐漸減少，以至于在一段時間內(nèi)產(chǎn)生的熱量與散發(fā)至周圍的熱量幾乎相等，這時發(fā)酵進(jìn)入“中挺期”，上層、中層、下層糟醅在該階段均持續(xù)約15 d。研究表明，進(jìn)入“中挺期”，一些產(chǎn)酸細(xì)菌逐漸占主導(dǎo)地位，糟醅發(fā)酵逐漸進(jìn)入產(chǎn)酸期。此時，由于產(chǎn)酸微生物的代謝作用，糟醅酸度逐漸增加，從而抑制不耐酸微生物的活性[8]?！爸型ζ凇敝?，糟醅發(fā)酵進(jìn)入了產(chǎn)香階段，窖池溫度緩慢下降，直至發(fā)酵結(jié)束。

2.2 發(fā)酵過程中酸度的變化

酸度是決定中國濃香型白酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。糟醅中適當(dāng)?shù)乃岫瓤梢砸种撇糠钟泻﹄s菌的生長繁殖，促進(jìn)呈香呈味物質(zhì)的形成，參與酯化過程。然而，糟醅酸度過高，發(fā)酵緩慢，產(chǎn)酒率降低。在本研究中，圖3顯示了不同層次糟醅在不同發(fā)酵時間的酸度變化規(guī)律。在發(fā)酵的前2周，各層糟醅的酸度無明顯變化。這是因為在發(fā)酵初期，溫度較低，窖池的微生態(tài)環(huán)境中的霉菌和酵母菌占優(yōu)勢，產(chǎn)酸菌的數(shù)量相對較少，所以生成酸很少[2]。隨著糟醅溫度的逐漸升高，由霉菌產(chǎn)生的大量還原糖被產(chǎn)酸細(xì)菌迅速利用，使得產(chǎn)酸細(xì)菌快速繁殖和代謝并在糟醅中占據(jù)優(yōu)勢地位。發(fā)酵后期酵母菌大量死亡，乙醇產(chǎn)生量較少，發(fā)酵主要進(jìn)入產(chǎn)酸期，在該階段各種有機酸不斷出現(xiàn)，并伴隨著酯化反應(yīng)。窖池各層糟醅酸度穩(wěn)步上升直至發(fā)酵結(jié)束。從圖3可以看出，下層糟醅的酸度高于上層和中層，這可能是由于上層和中層糟醅中溶解的一些有機酸和水落入下層，因而造成底層糟醅的高酸度[8]。

2.3 發(fā)酵過程中淀粉和還原糖含量的變化

圖3 不同層次糟醅中酸度隨發(fā)酵時間的變化趨勢

濃香型白酒釀造過程中，糟醅中淀粉和還原糖含量的動態(tài)變化既間接反映了乙醇生成和發(fā)酵狀態(tài)，也顯示了糟醅中微生物代謝活性。圖4顯示了不同層次糟醅中還原糖和淀粉含量隨時間的變化趨勢。

從圖4可以看出，入窖池時的上層、中層、下層糟醅中淀粉含量分別為22%、21.8%和21.3%，但經(jīng)過2周后，各層糟醅中淀粉含量迅速下降，原因可能是發(fā)酵前期糟醅中氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)相對豐富，使一些好氧微生物尤其是霉菌快速繁殖和代謝，產(chǎn)生大量糖化酶[2]。由于糖化酶的糖化作用，各層糟醅中還原糖含量逐漸增加，1周后均達(dá)到了最大值(圖4B)。但隨著糟醅溫度的上升，酵母菌等其他微生物迅速繁殖，又將還原糖用于自身生長及代謝，使還原糖濃度下降。由圖4還可以看出，發(fā)酵結(jié)束后，下層糟醅中殘留淀粉含量最高，原因可能是下層糟醅中低氧環(huán)境使糖化酶生成量減少；另外，還原糖殘留量在下層糟醅中也是最高的，這是由于下層糟醅中的酸度高，抑制了某些微生物的代謝活動，從而降低了還原糖的利用率。

圖4 不同層次糟醅中淀粉含量(A)和還原糖含量(B)隨發(fā)酵時間的變化趨勢

2.4 發(fā)酵過程中乙醇濃度的變化

乙醇是在糟醅的主發(fā)酵期產(chǎn)生的，其生成量的多少是判斷糟醅發(fā)酵是否正常的重要因素。本研究中，不同區(qū)域糟醅中乙醇含量隨時間變化趨勢見圖5。圖5表明，各層糟醅中乙醇濃度隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加，并在第5周時達(dá)到最大值。之后，糟醅發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)酸和產(chǎn)酯期，糟醅酸度不斷加大，從而抑制了酵母的活性，使得酵母細(xì)胞的數(shù)量在5周后迅速下降(圖5B)。同時，乙醇生成量在第5周后也在迅速減少。另外，由于糟醅中的乙醇可以作為前體，轉(zhuǎn)化為酸、酯、醛等其他香味物質(zhì)，在第5周至第7周時，使糟醅中乙醇濃度趨于下降，但7周后略有回升，這可能是由于某些酯類物質(zhì)的水解反應(yīng)所引起的[10]。

圖5 不同層次糟醅中乙醇含量(A)和酵母菌數(shù)(B)隨發(fā)酵時間的變化趨勢

2.5 發(fā)酵過程中水分含量的變化

傳統(tǒng)濃香型白酒釀造過程中，水是所有生化反應(yīng)所必不可少的，它不僅保證了窖池中微生物的生長代謝，也為微生物代謝產(chǎn)物如醇、醛、酸、酯等提供了有效的溶劑。另外，水分也影響著糟醅蒸餾過程中乙醇和香味物質(zhì)的提取。此外，水還有助于降低發(fā)酵糟醅酸度和調(diào)整窖池發(fā)酵溫度。因此，水分是濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵的一個重要控制指標(biāo)。不同區(qū)域糟醅中水分含量隨發(fā)酵時間變化趨勢見圖6。

從圖6可以看出，糟醅入窖時上層、中層、下層糟醅含水率均為54%～56%。發(fā)酵初期，糟醅中殘存的氧和營養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物大量生長，呼吸代謝會產(chǎn)生大量水，各層糟醅中的水分隨著時間的延長不斷增大。當(dāng)糟醅中的氧逐漸耗盡，整個發(fā)酵逐漸進(jìn)入乙醇發(fā)酵階段，該階段也會產(chǎn)一部分水。乙醇發(fā)酵結(jié)束后，糟醅進(jìn)入產(chǎn)酸、產(chǎn)酯階段，該階段上層、中層糟醅含水量繼續(xù)緩慢遞增，直至達(dá)到飽和(分別為61.2%和62.1%)，并保持幾乎不變直至發(fā)酵結(jié)束。而中層、上層糟醅流出的多余水分由于受重力作用向下移動，導(dǎo)致糟醅下層的水分含量比上層和中層高得多(圖6)。發(fā)酵結(jié)束后，糟醅中流出的多余水分與混在其中的殘余淀粉、糊精、可溶性氨基酸、多肽、乙醇和酵母細(xì)胞等下落至窖池底部形成了“黃水”，糟醅出窖前“黃水”被抽出窖池。

圖6 不同層次糟醅中含水量隨發(fā)酵時間的變化趨勢

2.6 發(fā)酵過程中4種主要酯類化合物的變化

據(jù)文獻(xiàn)報道，己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯4種酯類是組成濃香型白酒風(fēng)味的重要物質(zhì)，它們的含量和比例影響著濃香型白酒的質(zhì)量和風(fēng)格。四大酯中，己酸乙酯占主導(dǎo)地位，因其可使酒體口感甘甜爽口，是濃香型白酒的主體香味成分，其含量的多少也決定著濃香型白酒的風(fēng)格。發(fā)酵過程中不同層次糟醅的己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯的變化趨勢見圖7。

如圖7A所示，各層糟醅中己酸乙酯含量隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加，7周后達(dá)到最大值，然后略有下降，直至發(fā)酵結(jié)束。下層糟醅中己酸乙酯含量最高，分別較上層和中層高出53%和27%。乙酸乙酯和丁酸乙酯在發(fā)酵初期無法檢測到，直至2周后其濃度逐漸升高，到第7周兩者均達(dá)到了最高值，但之后均略有下降。各層糟醅中乳酸乙酯含量在發(fā)酵過程中是不斷遞增的，直至發(fā)酵結(jié)束達(dá)到最大值(圖7D)。圖7D還表明，各層糟醅中乳酸乙酯含量顯著高于其他3種酯類物質(zhì)，這和呂輝等報道的結(jié)果相同[4]。

在傳統(tǒng)濃香型白酒的固態(tài)發(fā)酵過程中，發(fā)酵糟醅中的乳酸菌主要來自于大曲、空氣、水、地面、器具、窖泥、設(shè)備，工人的手和鞋等[11]。通常，當(dāng)發(fā)酵糟醅中氧氣幾乎耗盡時(一般在發(fā)酵后14 d)，乳酸菌便開始繁殖并伴隨著乳酸的產(chǎn)生，從而抑制了大腸桿菌等有害微生物，從這一方面來看，乳酸菌對濃香型白酒的釀造是有益的。此外，糟醅中適當(dāng)?shù)娜樗岷坑兄谔岣甙拙祁悘?fù)合風(fēng)味，因此，此種情況下，乳酸菌是有助于白酒釀造的微生物。然而，若發(fā)酵糟醅中乳酸菌的數(shù)量過多，就會產(chǎn)生大量乳酸，在大曲酯化酶的作用下產(chǎn)生大量的乳酸乙酯，使得蒸餾出的白酒口感苦、悶，缺乏香氣，嚴(yán)重影響白酒質(zhì)量[12]。同時，過多的乳酸會抑制一些有益微生物的活力，尤其是己酸菌，因其適宜生長的pH值呈弱酸性或中性，耐酸能力不強[13]。因此，高濃度乳酸條件下，己酸菌數(shù)、己酸生成量以及己酸乙酯含量均會降低。另外，過高濃度的乳酸易與窖泥中鈣、鐵離子反應(yīng)，導(dǎo)致乳酸鈣、乳酸鐵、乳酸亞鐵的形成，加速了窖泥的硬化和老化[14]。環(huán)境和大曲中乳酸菌很容易進(jìn)入糟醅，其數(shù)量往往遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他功能菌尤其是己酸菌，最終會產(chǎn)生大量的乳酸乙酯，極大地影響白酒質(zhì)量。

在釀酒工業(yè)上，為了提高濃香型白酒質(zhì)量，有必要增加己酸乙酯的生成量和減少乳酸和乳酸乙酯的產(chǎn)生。截止目前，國內(nèi)研究人員采取了一系列措施，如保持生產(chǎn)環(huán)境清潔、控制用曲量、定期保養(yǎng)窖池和窖泥。此外，還有利用丙酸菌降解乳酸[15]等方法?？傊霸黾航等椤笔翘岣邼庀阈桶拙瀑|(zhì)量的一種有效方法，通常需要綜合考慮、多種手段協(xié)同作用。

圖8 不同層次糟醅中己酸(A)、乙酸(B)、丁酸(C)和乳酸(D)含量隨發(fā)酵時間的變化趨勢

2.7 發(fā)酵過程中4種主要有機酸的變化

己酸、乙酸、丁酸和乳酸是濃香型白酒糟醅中最重要的有機酸，該4種酸是己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯的前體物質(zhì)，也是形成濃香型白酒特殊風(fēng)味所必不可少的[7]。不同層次糟醅的己酸、乙酸、丁酸和乳酸隨發(fā)酵時間的變化趨勢見圖8。

由圖8可以看出，己酸、乙酸和丁酸在各層糟醅中具有相似的演變規(guī)律，發(fā)酵前2周，3種酸的增速非常緩慢，均在第6周時達(dá)到最大值，隨后持續(xù)下降直至第8周，這可能與該時間段內(nèi)酯化反應(yīng)有關(guān)。8周后3種酸均有輕微的增加趨勢。圖8還顯示了3種酸在下層糟醅中的含量均高于上層和中層，己酸尤為明顯，可能原因是下層糟醅與窖泥有較大的接觸面積。

乳酸的總體演變趨勢類似于其他3種有機酸(圖8)。由圖8可知，上層、中層、下層糟醅中乳酸的起始濃度分別為544 mg/100 g、552 mg/100 g和512 mg/100 g糟醅，發(fā)酵6周后，分別增加到1272 mg/100 g、1000.56 mg/100 g和 879.2 mg/100 g糟醅。隨后，各層糟醅中乳酸含量均緩慢下降直至第10周，隨后又略有上升趨勢。通常，乳酸快速增加與乳酸菌的代謝有關(guān)，而輕微的下降可能是由于乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸乙酯所造成的。

3 結(jié)論

本研究揭示了濃香型白酒窖池不同空間位置糟醅的發(fā)酵參數(shù)隨發(fā)酵時間的動態(tài)變化情況，發(fā)現(xiàn)不同空間位置的參數(shù)指標(biāo)表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。這些信息的獲得為探明濃香型白酒的發(fā)酵機制提供了一定的參考依據(jù)，也為濃香型白酒生產(chǎn)工藝管理提供一定的理論支持。

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